UPLC（超高效液相色譜）簡介
超越HPLC
隨著科學技術的進步，對液相色譜技術的要求也不斷提高，單從技術角度的改進已經不行。這就需要同時從科學與技術的角度出發，或者說從理論高度對液相色譜重新認識。因此，UPLC（超高效液相色譜）概念得以提出，將HPLC的極限作為自己的起點。
在1996年，Waters公司推出Alliance HPLC時的主要目標是提高液相色譜的"精度"。當時多數公司都認為HPLC技術已經發展到極致了、而同時用戶對性能沒有更高的需求，因此HPLC的目標應該是降低成本、走向更低的價格以獲得更廣泛的應用。
針對這樣的觀念，Waters公司提出：HPLC的技術沒有到達極限，用戶對HPLC有更高的要求，HPLC精度的提高對更好、更可靠的結果有極大的益處，對法規的遵從也是一個極大的促進。
站在當今世界科技前沿的液相色譜用戶現在又有了新的需求。
首先是改進生產力的需求，因為大量的樣品需要在很短的時間內完成，例如代謝組學分析；
其次是在生化樣品及天然產物樣品的分析中，樣品的復雜性對分離能力提出了更高的要求；
第三是在與MS及MS/MS等檢測技術聯用時，對連接的質量提出了更高的要求。
簡而言之，我們需要"更快地得到更好的結果"。
今天我們發現，隨著科學技術的進步，對液相色譜技術的要求也不斷提高，單從技術角度的改進已經不行。這就需要同時從科學與技術的角度出發，或者說從理論高度對液相色譜重新認識。因此UPLC（超高效液相色譜）概念的提出也就十分自然。簡而言之，UPLC是用HPLC的極限作為自己的起點。
理論基礎
早在1956年，J.J van Deemter就發表了他著名的理論：van Deemter曲線及其方程式。最早這個理論是用在氣相色譜上的，但是后來出現的液相色譜上也能應用這個理論。Waters公司引入UPLC的概念就是由研究這個著名的方程式開始。
首先探討一下這個著名的方程式。如果只關心理論塔板高度（H）與流速（線速度；u）及填料顆粒度（dp）之間的關系，就可以把該方程式作如下的簡化：
其中，A項代表了顆粒度和柱床填裝的優良程度；B項代表了軸向擴散；而C項則代表了傳質。從不同顆粒度的曲線中我們可以看到圖1所示的現象：
首先顆粒度越小柱效越高；其次每個顆粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；
最后，更小的顆粒度使最高柱效點向更高流速（線速度）方向移動，而且有更寬的線速度范圍。
所以降低顆粒度不但提高柱效，同時也提高速度。使用更高的流速會受到色譜柱填料耐壓及儀器耐壓的限制。
反之，如果不用到最佳流速，小顆粒度填料的高柱效就無法體現。另外，更高的柱效需要更小的系統體積（死體積）、更快的檢測速度等一系列條件的支持，否則小顆粒度填料的高柱效同樣無法充分體現。
因此，要真正創建一個全新的分離科學領域 －UPLC，必須解決以下問題：
■ 大幅提高色譜柱的性能；第一要解決小顆粒填料的耐壓問題，第二要解決小顆粒填料的裝填問題，包括顆粒度的分布以及色譜柱的結構。
■高壓溶劑輸送單元（超過15000psi）。
■ 完善的系統整體性設計，降低整個系統的體積，特別是死體積。并解決超高壓下的耐壓及滲漏問題。
■ 快速自動進樣器，降低進樣的交叉污染。
■ 高速檢測器；優化流動池以解決高速檢測及擴散問題。
■ 系統控制及數據管理，解決高速數據的采集、儀器的控制問題。
新型色譜填料及裝填技術
UPLC分離只有在新型的、耐壓而且顆粒度分布范圍很窄的1.7顆粒填料合成出來之后才有可能。色譜柱技術應該涵蓋幾個方面的內容：
首先是填料的合成，以得到高質量的填料顆粒，包括耐高壓、耐酸堿等等。
其次是顆粒的篩選，選出顆粒度分布盡可能窄的填料。
最后是裝填技術，以保證即堵住顆粒不使其外流，又不至于引起反壓的大幅升高。
Waters公司利用1999年發明的雜化顆粒技術（Hybrid Particle Technology － HPT），合成了第二代有機硅填料。它使用雙（三乙氧基硅）乙烷在硅膠中形成橋式乙基基團。這樣合成出來的填料在其內部有了更多的"交聯"結構，其機械強度有了極為顯著的提高，耐壓超過了20000psi。
使用這項技術，Waters公司合成了低于2顆粒度的填料―― 1.7顆粒度的"ACQUITY UPLCTM"填料。為了得到更好的耐壓能力及傳質作用，還優化了該填料的孔體積及孔徑。
傳統色譜柱填料的裝填技術受兩個方面的影響，導致現有小顆粒填料色譜柱的性能及質量均不能令人滿意。
首先是其顆粒度分布一般較寬，例如，5顆粒度填料中會有大量的4以下及6以上的顆粒，
因此，通常使用2篩板在色譜柱的出口攔截填料，阻止其外漏。
其次，如果使用低于2的篩板，篩板的反壓升高很快，甚至超過了填料所產生的反壓。因此，目前大多數3.5、2.5或更低顆粒度的填料還是使用2的篩板，只是在柱頭裝填一小段5的填料。因此現有小顆粒度填料的色譜柱與理論或理想狀態相距甚遠。
Waters公司的ACQUITY UPLCTM使用了更嚴格的篩分技術使1.7填料的分布很窄，并且使用了全新篩板（專利申請中）及其他色譜柱硬件（柱管及其連接件），在超過20000psi的壓力下裝填。Waters公司為此安裝了一條新的色譜柱裝填生產線及新的測試設備。因此，ACQUITY UPLCTM色譜柱的性能及質量有了質的飛躍。
填料的合成技術、顆粒的篩分技術、篩板及色譜柱硬件技術的提高，在更高的壓力下裝填色譜柱是UPLC色譜柱性能、質量保證的關鍵。
超高壓液相色譜泵
Waters公司具備制造超高壓泵的能力，UNC的Groove教授所用的超高壓液相色譜泵是Waters公司為其特別制造的。除了密封、高壓動力之外，超高壓色譜泵主要解決的問題是超高壓下溶劑的壓縮性及絕熱升溫（Adiabatic Heating）。
ACQUITY UPLCTM裝備一******立柱塞驅動、四個溶劑切換的兩元高壓梯度泵，其1ml/min流速時的耐壓可達15000psi，具有精確、可靠的梯度性能。新型的超高壓輸液泵使獨特的小顆粒填料技術可以在最優化的流速下工作，以充分發揮其特點。
集成改進的真空脫氣技術，使四個流動相溶劑及兩個進樣器洗針溶劑同時得到良好的脫氣。其梯度的重現性也非常好，盡管保留時間在1min以內，其重現性卻與HPLC的重現性不相上下。
自動進樣器
為了降低死體積、減少交叉污染，自動進樣器的設計使用了許多新技術，例如針內針樣品探頭（XYZZ’）、壓力輔助進樣等等。所謂"針內針"的XYZZ’設計，實際上就是使用液相色譜管路（PEEK材料）充當進樣針以減少死體積，而"外針"是一小段硬管，用來扎破樣品瓶蓋。
壓力輔助進樣在如此小的儀器的系統體積下保證可靠、重現的進樣是非常重要的措施。為了降低交叉污染，采用了一強、一弱的雙溶劑的進樣針清洗步驟，這兩個洗針溶劑也采取了脫氣措施。
高速檢測器
然而，在新的色譜柱技術支持下的高壓、高速UPLC對ACQUITY UPLCTM結果的檢測提出了挑戰。首先是速度問題，在短時間內出現如此多的色譜峰需要更快的數據采集速率相適應，至少要在10Hz以上，還需要降低樣品在檢測池內的駐留時間。當然同普通的HPLC檢測器一樣，信噪比也是新型檢測器的追求目標。
盡管因需要降低擴散而不得不使用很小體積的檢測池（<1），但是仍然要設法提高光能量通過及傳輸來降低噪音。同時必須使用更快的采樣速率、非常小的時間常數值，以適應UPLC所產生的非常窄的色譜峰。
ACQUITY UPLCTM使用新型光纖引導、Teflon AF池壁的流動池；10mm的光程（與普通HPLC相同）而體積只有500nL（普通HPLC的20分之一）。光束通過光纖完全引入流動池后，利用Teflon AF的特征在池壁內全折射，不損失光能量；同時采樣速率達到40點/s。
這樣設計的高速檢測器不但適應了UPLC高速及高分辨率的特征，而且還對UPLC靈敏度的提高有很大的幫助。
優化系統綜合性能的設計
Waters ACQUITY Ultra Performance LCTM系統的整體設計優化了超低系統體積及死體積，使之能獲得成功的UPLC所必須的低擴散、高速檢測所帶來的所有優點，同時還可以充分利用質譜電噴霧離子化接口的優點。
由于這個原因，ACQUITY UPLCTM系統會是理想的質譜接口。
當連接了我們的質譜技術時，ACQUITY UPLCTM系統的解決方案可以提供更靈敏的LC/MS及LC/MS/MS分析。例如；當與Micromass?LCT PremierTM連接時，數據的質量與速度有了驚人的改進。
應用
由于超高效液相色譜（UPLC）是一個新興的領域，Waters的ACQUITY UPLCTM系統也是剛剛出現，因此目前已發表的應用資料還很缺乏。與傳統的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。
因此首先想到的UPLC應用是代謝組學分析及其他一些生化領域。其他目前能夠想到的應用領域還包括天然產物的分析。使用UPLC與Tof或Q-Tof等質譜檢測器連接，會對天然產物分析，特別是中藥研究領域的發展是一個極大的促進。
多數生化樣品及天然產物都十分復雜，能被分離的色譜峰再多也會覺得不夠。圖3是多肽指紋圖的HPLC與UPLC兩個色譜圖（紫外檢測）比較。
在同樣條件下，UPLC能分離的色譜峰比HPLC多出一倍還多，因此我們有可能進一步研究：保持分離度而追求更快的分析速度，在相同時間內作更多的樣品，或優化分離度在同樣時間內再分出更多的色譜峰。
在提到"蛋白組學"或"代謝組學"時，與沒有"組"的差別從分析的角度說就是樣品量極大，需要在短時間分析成千上萬的樣品。UPLC不損失分離度的高速度優點在這里就能充分體現。
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