感受態(tài)細(xì)胞

感受態(tài)，英文是Competent Cell，令人納悶的是，直譯過(guò)來(lái)“有能力的細(xì)胞”。在實(shí)驗(yàn)里，它是在分子生物研究中的必備工具，一般為克隆與表達(dá)提供直接場(chǎng)所。

（轉(zhuǎn)化過(guò)程）

Part.01

自然界的感受態(tài)

你以為感受態(tài)細(xì)胞是科學(xué)家們定向改造的人工特有材料，那就大錯(cuò)特錯(cuò)了。

細(xì)胞呈現(xiàn)的這種開(kāi)放的“感受態(tài)”并非僅是實(shí)驗(yàn)室里的一種工具，從根本上說(shuō)，它們是某些微生物（主要是細(xì)菌或一些酵母）在進(jìn)化中獲得的一種主動(dòng)從環(huán)境中攝取外源DNA的生理狀態(tài)，繼而在大自然中獲得某些競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

比如當(dāng)細(xì)菌種群密度很高（群體感應(yīng)）、營(yíng)養(yǎng)匱乏（饑餓）或面臨其他環(huán)境脅迫時(shí)，一部分個(gè)體會(huì)進(jìn)入感受態(tài)。這是一種應(yīng)對(duì)危機(jī)時(shí)的冒險(xiǎn)策略，打開(kāi)細(xì)胞膜，冒險(xiǎn)吸收環(huán)境中任何DNA（可能來(lái)自死亡裂解的同類(lèi)或其他微生物），希望其中包含能幫助它渡過(guò)難關(guān)的基因，例如抗抗生素基因、毒力因子或新的代謝途徑。

除此之外，它們?cè)贒NA受到損傷（如紫外線(xiàn)、化學(xué)損傷）時(shí)，攝入的外源DNA片段可以作為修復(fù)模板，幫助細(xì)胞進(jìn)行同源重組修復(fù)，維持基因組完整性。

總之，自然感受態(tài)是一個(gè)受到精密遺傳調(diào)控的、主動(dòng)的生物學(xué)過(guò)程。

Part.02

克隆與表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞

在實(shí)驗(yàn)室中，我們需要的是大量、高效、同步進(jìn)入感受態(tài)狀態(tài)的細(xì)胞，并且要能長(zhǎng)期保存，因此，發(fā)展出了一套標(biāo)準(zhǔn)化的人工制備方法。

針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，科學(xué)家們培育出了多種具有不同遺傳背景的工程菌株，并制備成相應(yīng)的感受態(tài)細(xì)胞，常分為克隆用感受態(tài)和蛋白表達(dá)用感受態(tài)，兩者在關(guān)鍵基因上做了差異化改造。

（金沙生物感受態(tài)細(xì)胞）

克隆用感受態(tài)細(xì)胞代表有DH5α, TOP10, JM109，這些菌株通常經(jīng)過(guò)改造，如缺失核酸內(nèi)切酶（endA1突變）和重組酶（recA1突變），側(cè)重優(yōu)化質(zhì)粒穩(wěn)定性與產(chǎn)量（如 endA1, recA1突變），支持藍(lán)白斑篩選。

蛋白表達(dá)用感受態(tài)有BL21(DE3) 系列，配備高效表達(dá)系統(tǒng)，偏向于優(yōu)化蛋白產(chǎn)率與穩(wěn)定性。比如BL21(DE3)菌株基因組中整合了T7 RNA聚合酶基因，可受IPTG誘導(dǎo)，強(qiáng)力驅(qū)動(dòng)pET等載體上的目標(biāo)蛋白表達(dá)。

冷知識(shí)：

DH5α, TOP10, JM109、BL21這些都是大腸桿菌，但屬于大腸桿菌的不同“家族”或“譜系”，主要分為 K-12系列和 B系列。

DH5α中的DH是兩位作者的首字母（JM109也是），5代表了代表構(gòu)建過(guò)程中的特定系列或版本號(hào)；α通常表示這是一個(gè)來(lái)自DH5的衍生株或改進(jìn)版。JM109和Top10都是在DH5α基礎(chǔ)上做了改良，進(jìn)一步提高了轉(zhuǎn)化效率或特殊場(chǎng)景使用。Top10 是Invitrogen公司商品化菌株。

Part.03

電轉(zhuǎn)法與化學(xué)法區(qū)別

在人工誘導(dǎo)時(shí)，常見(jiàn)有兩種方式，分為電轉(zhuǎn)和化學(xué)法。前者用高壓電脈沖使細(xì)胞膜磷脂雙分子層發(fā)生暫時(shí)性的、可逆的電穿孔，形成納米級(jí)的孔洞，DNA分子直接通過(guò)電泳作用被“驅(qū)趕”進(jìn)細(xì)胞。

化學(xué)法則是用低溫（0-4°C）的氯化鈣（CaCl?）溶液反復(fù)懸浮和洗滌細(xì)胞，這也是最經(jīng)典的手段。其原理是Ca2?能中和細(xì)胞膜表面和DNA磷酸骨架的負(fù)電荷，減少靜電斥力，促進(jìn)DNA吸附在細(xì)胞表面。同時(shí)，Ca2?可能引起細(xì)胞膜局部結(jié)構(gòu)的紊亂。

在以上兩種方式中，電轉(zhuǎn)的效率極高（可達(dá)10? – 101? CFU/μg DNA），更加適用于大質(zhì)粒（如大于10Kb）、基因組DNA或酵母等難以用化學(xué)法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，但制備要求更嚴(yán)格。相比之下，化學(xué)法性?xún)r(jià)比更高，操作難度相對(duì)要低不少。

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