基因治療的基本程序
基因治療是在基因工程基礎上發展起來的分子生物學技術，它相對于現有其它治療方法較為復雜。基因治療的基本過程包括以下主要方面：
（一）目的基因的選擇和制備
基因治療的首要問題是選擇用于治療疾病的目的基因。對遺傳病而言只要已經研究清楚某種疾病的發生是由于某個基因的異常所引起的，其野生型基因就可被用于基因治療，如用ADA基因治療ADA缺陷病。但在現在的條件下，僅此是不夠的。
可用于基因治療的基因需滿足以下幾點：
在體內僅有少量的表達就可顯著改善癥狀；該基因的過高表達不會對機體造成危害。很顯然某些激素類基因如與血糖濃度相關的胰島素基因目前尚不能用于 糖尿病 的基因治療。
在抗病毒和病原體的基因治療中，所選擇的靶基因應在病毒和病原體的生活史和起重要的作用并且該序列是特異的，如針對HBV的HBeAg或X基因等。
腫瘤病人多有免疫缺陷，可選用免疫因子基因轉入人體，腫瘤細胞內往往存在多種基因異常形式，可采用反義技術封閉細胞內活化的癌基因或向細胞內轉入野生型抑癌基因，抑制腫瘤生簪，所針對的癌基因或抑癌基因應下該腫瘤的發生和發展有明確的相關性。
在確定欲選目的基因后，就在制備目的基因。正向表達的基因可以是cDNA（complementary DNA），也可是 基因組 DNA(genomic DNA)片段。可用傳統的方法獲取，也可采用多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction PCR)等新技術進行體外擴增。部分反義基因也可采用此法獲得，但多數情況下采用人工合成的方式制備。
（二）基因的轉運
目前已有多種基因轉運的方式，其基本原則是將外源基因運到細胞內。已使用的有病毒 載體 和非病毒 載體 兩大類。
病毒 載體 ：病毒具有一些獨特的性質如多數病毒可感染特異的細胞，在細胞內不易降解；RNA病毒能整合到染色體以及基因水平較高等。因此病毒載體是良好的基因轉運載體。目前已被用作載體的病毒有逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關的病毒。皰疹病毒和肝炎病毒等。逆轉錄病毒用作載體時需進行幾步改造：
（1）將天然的野生型RNA前病毒轉變成DNA載體，并插入欲轉移的相關外源基因。其基本原則是用標記基因和外源基因替代病毒的編碼基因。
（2）制備輔助細胞為載體DNA提供其喪失的功能。
（3）將載體DNA導入輔助以產生病毒載體。
（4）病毒載體感染靶細胞，外源基因在細胞內得以表達。
非病毒載體：這類載體的發展較快，目前主要是脂質體，一些具有受體功能的載體也呈現出誘人的前景，關于常見載體的優缺點列于表2。
表23－2 常見基因轉運載體的優缺點
| 載體 | 優點 | 缺點 |
| 逆轉錄病素毒 | 基因組小并且簡單 可穩定整合于宿主基因組 生物學特性清楚 可高效轉入復制中的細胞 對宿主細胞無害 | 僅感染分裂細胞 隨機整合（可能導致突變） 常常只有短暫表達 病毒滴度低（107pfu/ml） 可能會與有復制能務的病毒重組插入容量有限（10kb） |
| 腺相關病毒 | 基因組小（5kb） 可特異整合于人19號染色體 以人細胞作為宿主 無毒、無致病性 | 尚未研究清楚 需腺病毒輔助復制 攜帶外源基因能力有限（4kb） 難得到高滴度病毒 |
| 腺病毒 | 適于原位使用，尤其是肺 (在不分裂細胞中可進行高效率的體內感染) 病毒滴度高（1010pfu/ml） 生物學特性清楚 | 不與宿主基因組整合(只有短暫表達) 載本基因組復雜 病毒蛋白可能引起免疫反應及炎癥反應 插入外源基因能力有限（7-8kb） |
| 脂質體 | 無感染能力 理論上無DNA大小限制 毒性低 | 無特異性靶細胞 轉染效率低 僅有短暫表達 體內應用困難 |
| 受體介導的轉運 | 無感染能力 特異性轉染靶細胞 理論上無DNA大小限制 構建靈活 | 轉染效率低 體內應用困難 可能有免疫原性 只有短暫表達 |
（三）靶細胞的選擇
理論上講，無論何種細胞均具有接受外源DNA的能力，目前基因治療中禁止使用生殖細胞作為靶細胞，而只能使用體細胞，用于轉基因的體細胞必須取材方便，含量豐富，容易培養，壽命較長。可選擇的細胞有淋巴細胞、造血細胞、上皮細胞、角質細胞、內皮細胞、成纖維細胞、肝細胞、肌肉細胞和腫瘤細胞等。在實際上應用中應具體根據目的條件選擇。
（四）細胞轉染（tansfection）
將目的基因導入靶細胞的方法很多，大致可分為物理學方法、化學方法、融合法和病毒感染法四類。病毒法已在本節的“基因的轉運”中有基因介紹。目前較多使用的是脂質體法。
表23-3 DNA導入哺乳動物細胞常見的方法
| 名稱 | 機制 | 轉染效率 | 用途 | 優缺點 | 影響因素 |
| 磷酸鈣轉染法 | 內吞作用 | 20%細胞被轉染 | 瞬時表達 | 1、簡單有效 2、適用于貼壁、非貼壁細胞 3、常作首選方法 | 1、Ca2+，DNA濃度 2、PH值，沉淀反應時間 3、氯喹，甘油和丁酸鈉處理 |
| DEAE葡聚糖轉染法 | 抑制核酸酶 內吞作用 | 在BDC-1，CV-1和COS細胞中較高 | 瞬時表達 | 操作簡單 | 1、需高濃度DNa 2、DEAE葡聚糖濃度 3、溫育時間 |
| Poly-brene轉染法 | 不清楚 | 低分子量DNA轉染率高于磷酸鈣法 | CHO細胞的穩定轉化子 | 能得到較多的穩定轉化子 | 1、受體細胞類型 2、轉染調控信號 3、DNA濃度 |
| 原生質體融合 | 胞膜融合 | 50-100%轉染，穩定子得率為0.2-0.02% | 瞬時表達 穩定表達 | 1、操作復雜 2、不能進行共轉染 3、慎用于篩選營養缺陷型變異株 | 1、溶菌酶、PEG濃度 2、溫育時間 |
| 電穿孔 | 高壓在膜上形成微孔 | 效率較高 | 瞬時表達 穩定轉化 | 1、需精密儀器 2、可用于動物、植物細胞和細菌 | 1、電場強度 2、脈沖長度 3、溫度，DNA濃度 4、培養液 |
| 脂質體 | 脂膜融合 | 50-60%轉染 | 瞬時表達 穩定轉化 | 1、操作簡單 2、可用于體內試驗 | 1、脂質體質量 2、DNA濃度 |
| 胞核微注射法 | 直接注射 | 50-100%轉染 | 穩定轉化 | 1、需要特殊儀器 2、處理樣品數量少 3、高效 | 1、注射技術 2、DNA濃度 |
在目前的技術狀態下，一般而言其基因轉染效率很難達到100%。故必須首先將轉導細胞和未轉導細胞加以區分。這方面的新技術發展很快，常用的轉導細胞篩選方法有：
利用基因表達產物篩選法：
（1）標記基因篩選法：在載體上引入一個標記基因，或同時導入標記基因，在轉染后的適當時間選用合適劑量的選擇培養基，篩選標記基因表型，那些已導入外源基因的細胞將存活下來，而未轉錄的細胞則死于選擇性 細胞培養 基。如在較多的載體中都有neor標記基因存在，若向培養基中加入G418進行選擇，最后只有轉導細胞存活下來。
（2）基因缺陷型受體細胞的選擇性：以基因缺陷型細胞作為靶細胞，將正常基因導入基因缺陷型靶細胞后，使用選擇性培養基進行篩選。例如將TK基因導入TK-的靶細胞，轉錄細胞可在HAT培養基中生長，未轉導的細胞則不能在HAT培養基中生長。
（3）基因共轉染技術：將目的基因表達載體DNA和標記基因表達載體DNA混合后共同轉移到靶細胞中，分別使用標記基因和目的基因對應的選擇劑進行兩次篩選，最后得到復合轉導的轉化子。
分子生物學方法：外源基因是否真的轉入靶細胞必須用分子雜交方法進行證實。常用的方法有原位雜效，Southern雜交和打點雜交。其中主要問題是探針的選擇。若靶細胞內原來不存在所轉入的目的基因，可選用目的基因作為探針；靶細胞內一般無標記基因存在，故標記基因是良好的探針。探針大小可以是較大的DNA片段，亦可是人工合成的DNA單鏈探針分子。PCR方法目前也已用于轉導細胞的鑒定，且該法相對簡單易行。
（五）外源基因的表達及檢測
在篩選出轉化分子后還需要鑒定轉導細胞中外源基因的表達狀況。其中包括對目的基因和標記基因表達的鑒定。常用方法有原位雜交，Northrn雜交，NRA打點雜交，免疫組織化學染色等，前幾項是檢測外源基因轉錄出的mRNA，后者則是檢測外源基因翻譯出的蛋白質。流式細胞儀是一種較為客觀準確的儀器，可定量分析外源基因的表達狀況。
一些影響基因表達的因素如表4所示。
表23-4 調節重組細胞表達系統的DNA控制元件
| 啟動子 病毒啟動子：如LTRS，CMV，SV40啟動子在短時間后易于關閉，尤其是在逆轉錄病毒中 看家基因啟動子：如二氫葉酸還原啟動子可長期表達轉基因，但水平很低。 組織/細胞特異性啟動子：一些編碼含量豐富蛋白的基因的啟動子如肌肉中肌酸激酶的啟動子能夠進行特異性強表達 可誘導啟動子：如金屬硫蛋白基因的啟動子，類固醇誘導的啟動子可調節基因表達 |
| 其它調節轉錄的順式作用調節元件 增強子，位點控制元件，內含子序列及編碼序列本身可影響基因表達調節。 |
| 影響轉錄后表達的序列 3’-mRNA序列：對于穩定mRNA及進行翻譯可能是必需的。 |
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