流式CBA方法--檢測大鼠細胞因子實驗方案
1. 實驗所需試劑
1.1 RAT IFN-GMA CBA FLEX SET （558305）
規(guī)格：100TST
組成：Rat IFN-γ 標準品（4ml稀釋TOP濃度10000pg/ml），Rat IFN-γ PE 檢測二抗試劑，Rat IFN-γ捕捉微球（定位：A6）
1.2 RAT IL-10 CBA FLEX SET （558306）
規(guī)格：100TST
組成：Rat IL-10 標準品（4ml稀釋TOP濃度10000pg/ml），Rat IL-10 PE 檢測二抗試劑，Rat IL-10捕捉微球（定位：A8）
1.3 RAT IL-6 CBA FLEX SET （558308）
規(guī)格：100TST
組成：Rat IL-6 標準品（4ml稀釋TOP濃度10000pg/ml），Rat IL-6 PE 檢測二抗試劑，Rat IL-6捕捉微球（定位：A9）
1.4 RAT TNF CBA FLEX SET （558309）
規(guī)格：100TST
組成：Rat TNF 標準品（4ml稀釋TOP濃度10000pg/ml），Rat TNF PE 檢測二抗試劑，Rat TNF捕捉微球（定位：C8）
1.5 Rat IL-1a Flex Set (560159)
規(guī)格：100TST
組成：Rat IL-1a標準品（4ml稀釋TOP濃度10000pg/ml），Rat IL-1a PE 檢測二抗試劑，Rat IL-1a捕捉微球（定位： A4）
1.6 Rat IL-2 Flex Set (561420)
規(guī)格：100TST
組成：Rat IL-2標準品（4ml稀釋TOP濃度10000pg/ml），Rat IL-2 PE 檢測二抗試劑，Rat IL-2捕捉微球（定位：Bead E5）
1.7 Rat IL-4 Flex Set (558307)
規(guī)格：100TST
組成：Rat IL-4標準品（4ml稀釋TOP濃度10000pg/ml），Rat IL-4 PE 檢測二抗試劑，Rat IL-4捕捉微球（定位：Bead B9）
1.8 BD Cytometric Bead Array(CBA) Mouse/Rat Soluble Protein Master Buffer Kit(558266)
| Reagent | Quantity(558266) |
| Assay Diluent | 1 bottle, 30 mL |
| Capture Bead Diluent | 1 bottle, 5 mL |
| Detection Reagent Diluent | 1 bottle, 5 mL |
| Wash Buffer | 1 bottle, 130 mL |
| Instrument Setup Bead A1 | 1 vial, 0.25 mL |
| Instrument Setup Bead A9 | 1 vial, 0.25 mL |
| Instrument Setup Bead F1 | 1 vial, 1.0 mL |
| Instrument Setup Bead F9 | 1 vial, 0.25 mL |
| PE Instrument Setup Bead F1 | 1 vial, 0.25 mL |
| PE Positive Control Detector | 1 vial, 0.5 mL |
2. 實驗操作步驟：
2.1準備Rat Soluble Protein Flex Set標準品
（Rat Soluble Protein Flex Set標準品為干粉狀態(tài)，與檢測試劑混合前首先應(yīng)該重新稀釋。）
2.1.1 打開即將用于檢測對應(yīng)細胞因子標準品瓶子，將所有干粉轉(zhuǎn)移到15ml流式上樣管中，用4ml Assay Diluent溶液稀釋重懸，此管標記為TOP Standard，室溫靜止15min。
2.1.2 然后取9根管子，分別標記為1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128和1:256；每根管子加入500ulAssay Diluent稀釋液，按照下圖依次轉(zhuǎn)移500ul到下一管，完成梯度稀釋。
2.1.3 最后取根管標記為0pg/ml，只加入500ulAssay Diluent稀釋液。
2.1.4 最終實現(xiàn)如下表格的濃度梯度。
| Dilution tube | |||||||||
| Rat Soluble Proteim Flex Sex | Top Standard | 1:2 | 1: 4 | 1:8 | 1:16 | 1: 32 | 1: 64 | 1:128 | 1:256 |
| Protein (pg/mL) | 10,000 | 5,000 | 2,500 | 1,250 | 625 | 312.5 | 156 | 80 | 40 |
2.2 混合Rat Soluble Protein Flex Set捕捉微球（捕捉微球為50倍濃度保存，使用前應(yīng)稀釋為最佳反應(yīng)濃度）
2.2.1 按照實驗要求，每種微球單次檢測母液量為1ul，公式為：總體積=捕捉微球種類數(shù)*1ul*檢測樣本數(shù)+（捕捉微球種類數(shù)*1ul*檢測樣本數(shù)*49）
2.2.2 將稀釋好的捕捉微球標記為“Mixed Capture Beads”待用，不能長時間儲存。
2.2.3 稀釋待測樣本：大鼠標準品覆蓋范圍為40 to 10,000 pg/mL，如果預(yù)測待測樣本濃度過大，需對其進行稀釋。實驗者根據(jù)樣品預(yù)測濃度，選擇合適的稀釋比例，也可以使用多個稀釋比例摸索一個最佳稀釋量；稀釋緩沖液為Assay Diluent。大鼠血清和血漿一般要求稀釋4倍以上。
2.3準備大鼠Protein Flex Set檢測試劑
大鼠PE檢測試劑為50倍濃縮試劑，加入檢測管前要確保此時檢測試劑終濃度為50稀釋，單次反應(yīng)量為1ul。（注此過程需避光）
公式為：需要加入的Detection Reagent Diluent稀釋液=反應(yīng)次數(shù)*50ul-反應(yīng)次數(shù)*1ul。
2.4標準品以及樣品上機前處理步驟
2.4.1加入50ul大鼠Soluble Protein Flex Set Standard 稀釋液到10個流式管里，
| Well label | Standard dilution | Mouse Conc (pg/mL) | Rat Conc (pg/mL) |
| 1 | no standard dilution (Assay Diluent only) | 0 (negative control) | 0 (negative control) |
| 2 | 1:256 | 10 | 40 |
| 3 | 1:158 | 20 | 80 |
| 4 | 1:64 | 40 | 156 |
| 5 | 1:32 | 80 | 312.5 |
| 6 | 1:16 | 156 | 625 |
| 7 | 1:8 | 312.5 | 1,250 |
| 8 | 1:4 | 625 | 2,500 |
| 9 | 1:2 | 1,250 | 5,000 |
| 10 | Top Standard | 2,500 | 10,000 |
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