微生物基礎(chǔ)操作：微生物鑒定技術(shù)

1. 前言

本文主要介紹微生物實(shí)驗(yàn)室微生物鑒定的范圍，分離技術(shù)，形態(tài)如何描述、基礎(chǔ)生化試驗(yàn)、常見的微生物鑒定系統(tǒng)、鑒定結(jié)果出來后如何判斷來源及建議措施等內(nèi)容。

2. 定義

2.1 鑒定：借助于現(xiàn)有的微生物分類系統(tǒng)，通過特征測(cè)定，確定未知的、或新發(fā)現(xiàn)的、或未明確分類地位的微生物所應(yīng)歸屬分類群的過程。

2.2 培養(yǎng)物：一定時(shí)間一定空間內(nèi)微生物的細(xì)胞群或生長(zhǎng)物。如微生物的斜面培養(yǎng)物、搖瓶培養(yǎng)物等。

3. 內(nèi)容

3.1 鑒定表1范圍的微生物

表1鑒定范圍

3.2.1 大多數(shù)非無菌藥品生產(chǎn)過程和部分無菌生產(chǎn)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，對(duì)所檢出微生物的常規(guī)特征包括菌落形態(tài)學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、革蘭染色或其他染色特性，及某些能夠給出鑒定結(jié)論的關(guān)鍵生化反應(yīng)（如氧化酶、過氧化氫酶）進(jìn)行分析，一般即可滿足需要。

3.2.2 無菌試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性、無菌生產(chǎn)模擬工藝(如培養(yǎng)基灌裝)失敗、環(huán)境嚴(yán)重異常事件時(shí)，對(duì)檢出的微生物鑒定至少達(dá)到種水平，必要時(shí)需達(dá)到菌株水平。

3.2.3 微生物實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)菌種使用前需要進(jìn)行驗(yàn)收，包括形態(tài)學(xué)描述，基礎(chǔ)生化試驗(yàn)等，條件具備的需要鑒定到種屬。

3.3 分離技術(shù)

3.3.1 分段劃線分離法

? 當(dāng)菌苔或濃的菌液多用此法進(jìn)行分離。從平板表面涂抹培養(yǎng)物的地方開始劃線，每劃連續(xù)的一組線段后，再與上段劃線相交數(shù)次劃出下一組的連續(xù)線段，如此劃到第四或第五段，合蓋即成。如圖1所示。

圖1 平板分段劃線（左）及培養(yǎng)后菌落分布示意圖

3.3.2 連續(xù)劃線分離法

? 含菌量較少的菌液多用此法進(jìn)行分離。從平板表面涂抹培養(yǎng)物的地方開始劃線，連續(xù)向整個(gè)表面左右展開并一直劃完，形成一條接種曲線。如圖2所示。

圖2 平板連續(xù)劃線法（左）及培養(yǎng)后菌落分布示意圖

3.3.3 注意事項(xiàng)

? 劃線分離用的平板應(yīng)保持適宜的濕度，在表面不能有凝集水，以免細(xì)菌在接種線蔓延生長(zhǎng)，菌落相互依聯(lián)。

3.4 菌落形態(tài)表述

3.4.1 細(xì)菌形態(tài)表述

? 菌落形態(tài)從大小、形狀（圓形、假根形、不規(guī)則形等)、隆起形狀（如擴(kuò)展、苔狀、低凸、凸面、乳頭狀等)，邊緣（整齊、波狀、裂葉狀、圓鋸齒狀、有緣毛等)，表面狀態(tài)（光滑、皺褶、顆粒狀、龜裂狀、同心環(huán)狀等)，表面光澤（閃光、不閃光、金屬光澤等)，質(zhì)地（油脂狀、膜狀、黏、脆等)，顏色，透明程度（不透明、半透明）等方面來描述。

3.4.2 霉菌形態(tài)表述

? 生長(zhǎng)速度：培養(yǎng)一定天數(shù)、測(cè)量菌落直徑，以生長(zhǎng)極慢、慢、中等、快等說明。

? 菌落表面：平滑或有皺紋、致密或疏松，有無同心環(huán)或輻射狀溝紋。菌落全部、中心及邊緣部分分別記錄。

? 色：表面、底部和菌落背面顏色及變化。

? 菌落質(zhì)地：外觀似氈狀、絨毛狀、棉絮狀、羊毛狀、束狀、粉粒狀、明膠狀或皮革狀等。

? 菌落邊緣：全緣、鋸齒、樹枝或纖毛狀。

? 菌落高度：扁平、丘狀隆起、陷役，或菌落中心部分凸起或凹路。

? 培養(yǎng)基顏色變化：菌落周圍有無色素?cái)U(kuò)散到培養(yǎng)基內(nèi)。

? 滲出物：菌落表面有無帶顏色的液滴。

? 氣味:霉味、土氣味、芳香味、無味等。

3.4.3 酵母菌形態(tài)表述

? 酵母菌在玫瑰紅鈉瓊脂平板上的菌落表面濕潤(rùn)、黏稠，類似細(xì)菌菌落，但多數(shù)為圓形乳白色，少數(shù)紅色，微凸、邊緣整齊，少數(shù)呈毛狀，偶有干皺型。

? 酵母菌為單細(xì)胞，無菌絲，故菌落不深入基質(zhì)，與培養(yǎng)基結(jié)合不緊密，用接種環(huán)極易黏起菌落培養(yǎng)物。并在水中易分散。

? 在瓊脂內(nèi)的菌落除圓形外，常有鐵餅形、三角及多角形。

3.5 基礎(chǔ)生化試驗(yàn)

3.5.1 觸酶（過氧化氫酶）試驗(yàn)

3.5.1.1  原理

? 具有過氧化氫酶的細(xì)菌培養(yǎng)物，加入過氧化氫試液，立即產(chǎn)生氣泡。

3.5.1.2 本試驗(yàn)?zāi)c用于鑒別葡萄球菌、微球菌（陽(yáng)性）與鏈球菌。乳酸菌及梭菌為陰性反應(yīng)。

3.5.1.3  方法

? 用塑料接種環(huán)挑取菌落一環(huán)，置于潔凈載玻片上，滴加觸酶試劑數(shù)滴，立即觀察結(jié)果。如產(chǎn)生氣泡為陽(yáng)性反應(yīng)，不產(chǎn)生氣泡者為陰性反應(yīng)。

3.5.2 氧化酶試驗(yàn)

3.5.2.1  原理

? 氧化酶不直接與氧化酶試劑反應(yīng)，而是首先使細(xì)胞色素c氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素c再使對(duì)苯二胺試劑氧化，使之成為玫瑰紅色到暗紫色的醌類化合物。

3.5.2.2 本試驗(yàn)主要用于奈瑟球菌屬鑒別，區(qū)別假單胞菌科與氧化酶陰性的腸桿菌科細(xì)菌。

3.5.2.3  方法

? 取潔凈的濾紙，用塑料無菌接種環(huán)挑取新鮮待檢菌的菌苔或菌落少許，涂于濾紙上，滴加氧化酶試劑，菌落立即呈現(xiàn)玫瑰紅色、繼而變深，并于30秒內(nèi)呈現(xiàn)深紫色為陽(yáng)性反應(yīng)。不變色為陰性反應(yīng)。或根據(jù)廠家說明書來進(jìn)行操作。

3.5.3 注意事項(xiàng)

3.5.3.1 待檢菌應(yīng)是純培養(yǎng)物，否則所觀察的生化反應(yīng)可能是兩種或多種菌的混合反應(yīng)，造成試驗(yàn)紊亂，無法得出正確的鑒定結(jié)果。

3.5.3.2 待檢細(xì)菌最好采用18~24小時(shí)的新鮮培養(yǎng)物，此時(shí)細(xì)菌群體細(xì)胞的生理特征比較一致。培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)或陳舊的培養(yǎng)物，細(xì)胞衰退，生理特征亦會(huì)發(fā)生改變，常會(huì)影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.5.3.3 嚴(yán)格遵守觀察反應(yīng)的時(shí)間，時(shí)間過短或過長(zhǎng)，不能觀察到正確結(jié)果。

3.5.3.4 染菌的物品需要經(jīng)過高壓121℃30min及以上溫度和時(shí)間的滅菌后,按照EHS要求處理。

3.6 酵母菌鑒定

? 當(dāng)其外觀與細(xì)菌菌落不易區(qū)別時(shí)，可將平板置低倍顯微鏡下，觀察菌落邊緣。酵母菌菌落的邊緣由可分辨的小珠或魚卵狀酵母細(xì)胞組成。或挑取菌落少許，加水制成薄涂片、加蓋玻片，置高倍顯微鏡下觀察，可見比細(xì)菌大數(shù)倍的圓形、卵圓形并帶有芽體的酵母細(xì)胞，甚易識(shí)別。當(dāng)平板內(nèi)酵母菌菌落甚多時(shí)，常有酒香氣味。

? 必要時(shí)可進(jìn)行基因型微生物鑒定。

3.7 霉菌鑒定

3.7.1 形態(tài)觀察

? 菌絲粗大，寬約4.0~8.0微米，無色透明或呈現(xiàn)各種鮮艷的顏色，有營(yíng)養(yǎng)菌絲與繁殖菌絲之分。多數(shù)霉菌菌絲有分隔，為多細(xì)胞分枝絲狀體。菌落形態(tài)較大，質(zhì)地蔬松，外觀干燥，不透明，菌落與培養(yǎng)基間連接緊密，不易挑取，菌落正反面，邊緣與中心的顏色、構(gòu)造通常不一致，有霉味。

3.7.2 必要時(shí)可進(jìn)行基因型微生物鑒定。

3.8 常見鑒定系統(tǒng)

3.8.1 BBL Crystal鑒定系統(tǒng)

是一種以熒光、顯色技術(shù)相結(jié)合的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，使用5種鑒定板條，采用30種鑒定反應(yīng)，可在最短4小時(shí)內(nèi)鑒定包括革蘭氏陽(yáng)性菌、奈瑟/嗜血菌、厭氧菌、腸/非發(fā)酵菌在內(nèi)的500多種微生物。

3.8.2 API鑒定系統(tǒng)

3.8.2.1 定義

法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的基于數(shù)值分類鑒定技術(shù)，通過計(jì)算反應(yīng)性狀出現(xiàn)的頻率來進(jìn)行的一種小型的微生物鑒定系統(tǒng)。

3.8.2.2 API鑒定概率說明（圖3）

 圖3 API鑒定概率說明

3.8.2.3 如果第一個(gè)菌名的鑒定概率＞80%，則可將未知菌定為該菌名；

3.8.2.4 如果第一個(gè)菌名的鑒定概率＜80%，就將前面兩個(gè)菌加在一起，還不足80，就將第三個(gè)也加在一起，若其和超過80，如果這幾個(gè)菌都是同一個(gè)“種”內(nèi)的不同生物型，則可稱為鑒定到種級(jí)水平；如果這幾個(gè)菌都屬于同一個(gè)屬內(nèi)，則稱為鑒定到屬級(jí)水平。

3.8.2.5 如果頭三個(gè)菌的%id之和＜80，則此結(jié)果應(yīng)定為不可接受的。

3.8.2.6 圖示舉例（好的鑒定結(jié)果）（圖4）

圖4好的鑒定結(jié)果

3.8.2.7 圖示舉例（可接受的鑒定結(jié)果）（圖5）

圖5可接受的鑒定結(jié)果

3.8.2.8 圖示舉例（低分辨率的鑒定結(jié)果）（圖6）

圖6低分辨率的鑒定結(jié)果

3.8.3 Vitek 2 compact全自動(dòng)微生物鑒定儀

VITEK 2 COMPACT是全自動(dòng)微生物系統(tǒng)用于鑒定細(xì)菌和酵母菌及藥敏試驗(yàn)，微生物各自的新陳代謝不同，生化譜也就不同, 通過各種生化反應(yīng)，包括酶的反應(yīng)，酸化試驗(yàn)，產(chǎn)堿試驗(yàn)，同化試驗(yàn)，抑制試驗(yàn)等方法，根據(jù)顏色或濁度的變化，儀器自動(dòng)判讀，達(dá)到判讀閾值時(shí)，自動(dòng)處理生化譜，最終得出屬或種的鑒定結(jié)果。

3.8.4 全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)

采用MALD-TOF技術(shù)（基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜）獲取質(zhì)量圖譜并通過數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行分析，從而完成微生物鑒定。

3.9 鑒定時(shí)常見污染菌來源及建議措施（供參考），見表2。

表2 常見污染菌來源及建議措施（供參考）