水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的測(cè)定——?dú)庀嗌V法（二）
7 測(cè)定步驟
7.1 樣品預(yù)處理
魚去鱗、皮，沿背脊取肌肉身；蝦去頭、殼、附肢，取可食肌肉部分；蟹、中華鱉等取可食肌肉部分；樣品切為不大于0.5cmX0.5cmX0.5cm的小塊后混勻，放置冰箱中冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/span>
7.2 提取
將樣品解凍，稱取樣品5g（精確至0.001g），置于50mL玻璃離心管中，加入乙酸乙酯20mL，均質(zhì)機(jī)均質(zhì)1min，分散均勻，提取氯霉素，4000r/min離心3min，將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移到100mL細(xì)口雞心瓶中。再向離心管中加乙酸乙酯10mL，用原均質(zhì)機(jī)均質(zhì)混合1min，4000r/min離心3min，合并乙酸乙酯提取液于100mL細(xì)口雞心瓶中，于40°C水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。
注：均質(zhì)機(jī)清洗方法，先用大量水浸洗，再用甲醇浸洗，最后用蒸餾水浸洗。
7.3 脫脂凈化
向雞心瓶中加1mL甲醇渦旋混合溶解殘留物，再加入15mL正己烷和25mL4%氯化鈉溶液，蓋塞振蕩混合1min，充分混合提取脂肪，轉(zhuǎn)移到另一50mL離心管中，4000r/min的速度離心2min，除去上層正己烷相并棄去。再向水相中加10mL正己烷，重復(fù)提取一遍，棄去正己烷相。
水相中加入15mL乙酸乙酯，渦旋混合器混合2min，3000r/min離心3min，吸取乙酸乙酯層，經(jīng)過無水硫酸鈉柱脫水過濾于50mL雞心瓶中。再向水相中加入5mL乙酸乙酯，重復(fù)上述操作。用少量乙酸乙酯淋洗無水硫酸鈉柱，合并提取液于50mL雞心瓶中，在40°C水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。對(duì)于大部分樣品，到此步驟凈化效果已可達(dá)到要求，對(duì)于凈化不完全的樣品可經(jīng)C18固相萃取柱進(jìn)一步凈化。
加入2mL乙酸乙酯溶解提取物并轉(zhuǎn)移于5mL具塞離心管中.用1mL乙酸乙酯洗滌雞心瓶，合并乙酸乙酯，于50°C~55°C的砂浴中吹氮蒸發(fā)至近干，再用1mL乙酸乙酯洗滌離心管壁并吹干。注意防潮。
7.4 C18柱凈化
注意：以下步驟必須連續(xù)做完，切莫讓吸附劑變干。
給每個(gè)樣品準(zhǔn)備一根C18柱，順序用5mL甲醇、5mL氯仿、5mL甲醇和5mL水淋洗活化C18柱，棄掉洗滌液。用5mL體積分?jǐn)?shù)為5%的乙腈水溶液溶解7.3中在40°C水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干的提取物，吸取水溶液裝入C18柱過柱，棄掉流出液。注意流速保持每秒一滴，否則凈化效果和回收率都較差。用1mL水淋洗雞心瓶2遍，并將淋洗液加入C18柱過柱，棄掉流出液。用5mL水淋洗C18柱，讓洗滌液完全流出C18柱，用微氮吹干。用乙腈將08柱中的氯霉素洗脫，洗脫2次，每次1.5mL，合并洗脫液于5mL具塞離心管中。在溫度50°C~55°C的砂浴中，用氮?dú)獯党译嬷两桑儆?mL乙腈洗滌離心管壁并用氮?dú)獯蹈伞Ｗ⒁夥莱薄?/span>
7.5 衍生化
7.5.1 試樣的衍生化
向干的殘留物中加100μL衍生化試劑，蓋塞并渦旋混合10s，在70°C烘箱中反應(yīng)30min。再在50°C?55°C砂浴中，用氮?dú)饬鞔党嘤嗟脑噭翗悠饭軇偤么蹈蔀橹?注意：此步過長(zhǎng)的吹干時(shí)間可導(dǎo)致丟失分析物)。加入0.5mL正己烷，渦旋混合10s，供氣相色譜分析用。
7.5.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的衍生化
取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液于5mL具塞離心管中，在溫度50°C~55°C的砂浴中，用氮?dú)獯党軇┲粮伞Ｒ韵掳?.5.1的步驟操作。
7.6 樣品測(cè)定
分別注入1μL適當(dāng)濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)硅烷化衍生物溶液及樣品提取物硅烷化衍生物溶液于氣相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。
7.7 計(jì)算
樣品中氯霉素的含量按式(1)計(jì)算。
式中：
X——樣品中氯霉素含量，單位為微克每千克( μg/kg)；
cs——標(biāo)準(zhǔn)衍生物溶液相當(dāng)氯霉素含量，單位為納克每毫升(ng/mL)；
A——試樣液中氯霉素衍生物的峰面積或峰髙，單位為微伏秒或毫米( μV?s或mm)；
V——樣品提取物衍生化溶液體積，單位為毫升(mL)；
As——氯霉素標(biāo)準(zhǔn)衍生物的峰面積或峰高，單位為微伏秒或毫米( μV?s或mm)；
m——樣品質(zhì)量，單位為克(g)。
注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。
8 方法回收率
標(biāo)準(zhǔn)添加濃度為0.1μg/kg?20.0μg/kg時(shí)，回收率≥70%。
9 方法檢測(cè)限
本方法檢測(cè)限：0.3μg/kg。
10 允許差
2次平行測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差≤15%。
11 方法的線性范圍
本方法的線性范圍：標(biāo)準(zhǔn)衍生物溶液相當(dāng)氯霉素濃度為0.5ng/mL?250ng/mL。
文章來源：《水產(chǎn)品獸藥殘留限量及監(jiān)測(cè)方法查詢手冊(cè)》
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