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微生物學(xué)通報(bào)】基于5′mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化的鹵醇脫鹵酶高效表達(dá)及應(yīng)用
發(fā)布日期：2025-12-19 15:26:29


微生物學(xué)通報(bào)】基于5′mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化的鹵醇脫鹵酶高效表達(dá)及應(yīng)用


摘 要

目的鹵醇脫鹵酶作為一種生物催化劑，兼具閉環(huán)與開(kāi)環(huán)反應(yīng)活性，在手性環(huán)氧化合物等合成領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其綠色高效制備具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)鹵醇脫鹵酶HheC編碼序列N端進(jìn)行基于mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)HheC的高效表達(dá)，并將其應(yīng)用于手性環(huán)氧氯丙烷的合成。

方法采用mRNA預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)5′mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與熱力學(xué)性質(zhì)，以降低mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、提高折疊自由能(ΔG)為目標(biāo)，在不改變氨基酸序列的前提下設(shè)計(jì)高表達(dá)5′mRNA序列，并表征酶的表達(dá)效率和催化性能。

結(jié)果基于5′mRNA序列設(shè)計(jì)獲得了HheC突變體，其蛋白表達(dá)水平從16.71%提升至33.39%，對(duì)1,3-二氯-2-丙醇的相對(duì)酶活提高了3倍。

結(jié)論基于5′mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化可顯著提高HheC表達(dá)水平，提升目標(biāo)產(chǎn)物合成效率，為構(gòu)建酶法催化合成手性環(huán)氧氯丙烷路線奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 鹵醇脫鹵酶；mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)；翻譯表達(dá)調(diào)控

鹵醇脫鹵酶(halohydrin dehalogenases, HHDHs, EC 4.5.1.X)是一類(lèi)重要的生物催化劑，它能夠催化鄰鹵醇羥基對(duì)鹵素進(jìn)行分子內(nèi)親核取代反應(yīng)，生成對(duì)應(yīng)的環(huán)氧化物與鹵化氫；同時(shí)，也能催化相應(yīng)的逆反應(yīng)，即受N3-、CN-、NO2-等親核試劑進(jìn)攻，催化環(huán)氧化物開(kāi)環(huán)，具有與轉(zhuǎn)氨酶、大部分脫氫酶類(lèi)似的雙向催化功能。根據(jù)序列同源性與結(jié)構(gòu)特征的差異，鹵醇脫鹵酶可分為A-G等多個(gè)亞型[1-2]。其中，HheC對(duì)短鏈鄰鹵醇具有高活性和高選擇性，在手性環(huán)氧氯丙烷、他汀側(cè)鏈、惡唑烷酮等合成中具有重要應(yīng)用，其高效制備也備受關(guān)注[3-4]。
在現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域，外源基因在宿主生物中的高效表達(dá)已成為眾多應(yīng)用的基石。影響外源基因在宿主中高效表達(dá)的關(guān)鍵因素是多方面的，包括基因序列的優(yōu)化、合適啟動(dòng)子及調(diào)控元件的選擇，以及對(duì)宿主細(xì)胞翻譯機(jī)制的調(diào)控。其中，mRNA結(jié)構(gòu)，尤其是5′mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)被視為關(guān)鍵因素之一。mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠顯著影響翻譯起始效率，進(jìn)而影響所編碼蛋白質(zhì)的整體表達(dá)水平[5-8]。適當(dāng)?shù)膍RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)有助于蛋白質(zhì)的正確折疊[5]，改善核糖體的分配，防止核糖體碰撞與堵塞，提高翻譯效率[6,9]。反之，高穩(wěn)定性的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能阻礙核糖體的移動(dòng)，使核糖體需要更長(zhǎng)時(shí)間解開(kāi)配對(duì)的堿基，導(dǎo)致“翻譯停滯”[8]；核糖體下游高穩(wěn)定性的二級(jí)結(jié)構(gòu)甚至可能引發(fā)移碼突變[10]。此外，ΔG是衡量RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的關(guān)鍵熱力學(xué)參數(shù)，反映了RNA分子折疊成特定結(jié)構(gòu)時(shí)的能量變化。ΔG越低(即負(fù)值越大)表明形成該結(jié)構(gòu)需要釋放更多能量，二級(jí)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。
對(duì)于翻譯起始而言，翻譯起始區(qū)(translation initiation region, TIR)是啟動(dòng)翻譯的重要功能區(qū)域，包括核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site, RBS)、SD序列(Shine-Dalgarno sequence)、起始密碼子及其下游的部分序列[11]。TIR序列對(duì)翻譯起始的影響可歸因于區(qū)域內(nèi)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)引起的核糖體可及性差異。TIR內(nèi)一定程度的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠延長(zhǎng)其半衰期，防止其被過(guò)早降解[12-13]，且由于30S亞基與RBS之間具有較強(qiáng)的親和力，并不影響二者的結(jié)合[14-15]。當(dāng)mRNA穩(wěn)定性達(dá)到一定閾值時(shí)，其穩(wěn)定性與翻譯效率呈負(fù)相關(guān)，穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)阻礙二者結(jié)合，從而抑制翻譯起始，顯著影響目的基因表達(dá)[16-17]。此外，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在調(diào)控目的蛋白表達(dá)水平中發(fā)揮著多維度作用，涉及核糖體結(jié)合效率、翻譯起始復(fù)合體組裝、mRNA降解動(dòng)力學(xué)及其與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的耦合機(jī)制。結(jié)構(gòu)緊密的5′mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可遮蔽核糖體結(jié)合位點(diǎn)(如起始密碼子AUG附近或SD序列)，阻礙小亞基裝載，顯著抑制翻譯起始[18]；還能通過(guò)限制eIF4E、eIF4G等起始因子對(duì)mRNA帽結(jié)構(gòu)的結(jié)合，抑制翻譯起始復(fù)合體的形成[19]。由此可見(jiàn)，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊方式與穩(wěn)定性能夠通過(guò)多種機(jī)制影響蛋白質(zhì)的合成速率，這為聚焦于5′mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，提升鹵醇脫鹵酶在大腸桿菌(Escherichia coli)中的異源表達(dá)水平提供了重要指導(dǎo)。
本研究以HHDH亞型之一的鹵醇脫鹵酶HheC為研究對(duì)象。通過(guò)降低編碼序列5′mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性在不改變氨基酸序列的前提下提高HheC在大腸桿菌中的異源表達(dá)水平，并表征酶的表達(dá)效率及其對(duì)1,3-二氯-2-丙醇(1,3-dichloro-2-propanol, 1,3-DCP)的催化性能，以期為手性環(huán)氧氯丙烷的酶法合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株
本研究使用的表達(dá)宿主為E. coli BL21(DE3)，表達(dá)載體為pET-28b(+)，二者均由本實(shí)驗(yàn)室保藏；研究對(duì)象鹵醇脫鹵酶HheCL143N/A159T/P175S/W249P為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，標(biāo)記為HheCM4。
1.1.2 培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.4。
LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20 g/L的瓊脂粉配制而成。

1.2 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與熱力學(xué)性質(zhì)預(yù)測(cè)

1.2.1 基于ViennaRNA的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與熱力學(xué)性質(zhì)分析
為提高mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度，準(zhǔn)確反映熱力學(xué)性質(zhì)變化趨勢(shì)，本研究采用3種不同算法的預(yù)測(cè)工具對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與熱力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。利用ViennaRNA在線工具(http://rna.tbi.univie.ac.at/)[20-21]對(duì)5′mRNA (基于起始密碼子的80 nt序列)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、折疊自由能變化(ΔG)及核苷酸熱力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。其mRNA折疊算法包括最小自由能(minimum free energy, MFE)模型與配分函數(shù)(partition function)模型。MFE模型通過(guò)搜索自由能最低的構(gòu)象來(lái)預(yù)測(cè)序列最穩(wěn)定的折疊結(jié)構(gòu)；配分函數(shù)模型基于統(tǒng)計(jì)力學(xué)框架計(jì)算所有可能構(gòu)象的熱力學(xué)加權(quán)，從而獲得堿基配對(duì)概率與結(jié)構(gòu)多樣性信息，并設(shè)置避免孤對(duì)堿基對(duì)(avoid isolated base pairs)以提高預(yù)測(cè)結(jié)果的合理性。選擇Turner模型(2004)[22]的熱力學(xué)參數(shù)，設(shè)定折疊溫度為37 ℃，在1 mol/L鹽濃度下進(jìn)行能量計(jì)算。
1.2.2 基于Mfold的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與熱力學(xué)性質(zhì)分析
源于UNAFold在線工具(https://www.unafold.org/mfold/applications/rna-folding-form.php)的Mfold模塊[23]同樣是基于最小自由能原理開(kāi)發(fā)的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)算法。其核心采用Zuker等提出的動(dòng)態(tài)規(guī)劃(dynamic programming)算法[24]與Turner模型(1999)[25]的熱力學(xué)參數(shù)系統(tǒng)性地搜索所有可能的堿基配對(duì)組合，從而精確識(shí)別最穩(wěn)定構(gòu)象及多個(gè)亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)。該模塊提供靈活的結(jié)構(gòu)約束功能，支持強(qiáng)制配對(duì)、禁配設(shè)定和多鏈雜交模擬，在寡核苷酸設(shè)計(jì)、引物篩選、RNA干擾等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。設(shè)定折疊溫度為37 ℃，在1 mol/L鹽濃度下進(jìn)行能量計(jì)算。
1.2.3 基于UFold的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
UFold[26]基于深度學(xué)習(xí)框架，通過(guò)端到端的圖像化神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型實(shí)現(xiàn)高精度與高效率的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。其主體采用U-Net模型[27]全卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)，能夠在保持位置信息的同時(shí)逐層提取局部與全局特征。通過(guò)對(duì)L×L的配對(duì)矩陣進(jìn)行對(duì)稱性處理，篩除不符合RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)物理約束的配對(duì)，并結(jié)合線性規(guī)劃進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，最終獲得符合熱力學(xué)與幾何限制的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)模型。該方法相比傳統(tǒng)自由能最小化方法具有更高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性與處理效率，在處理假結(jié)預(yù)測(cè)與長(zhǎng)程配對(duì)識(shí)別任務(wù)中表現(xiàn)更優(yōu)秀。

1.3 重組菌株構(gòu)建

以HheCM4為模板，通過(guò)全質(zhì)粒PCR對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行突變。質(zhì)粒DNA由質(zhì)粒小提試劑盒(購(gòu)自北京擎科生物科技股份有限公司)提取獲得。引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×Phanta Max Buffer (p505) 12.5 μL，dNTP Mix (10 mmol/L) 0.5 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.25 μL，均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板0.1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物后，用Dpn I于37 ℃消化模板，通過(guò)熱激法將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落送北京擎科生物科技股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

表1   5′mRNA突變引物序列Table 1   Mutant primers of 5′mRNA sequences

a：下游通用引物。

a: Downstream universal primer.


1.4 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與分析

1.4.1 誘導(dǎo)表達(dá)
挑取重組菌落至含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基試管中，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。按2%體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.6-0.8，加入IPTG (終濃度0.1 mmol/L)進(jìn)行目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，28 ℃、180 r/min誘導(dǎo)12 h后，于8 000 r/min離心10 min，去除上清液后得到濕菌體，用于后續(xù)的分析與催化反應(yīng)。
1.4.2 蛋白表達(dá)分析
將50 g/L重組菌重懸于PB緩沖液(20 mmol/L, pH 7.4)，在冰水浴下以180 W超聲破碎10 min (超聲時(shí)間2 s，間隔時(shí)間4 s)至澄清，4 ℃、12 000 r/min離心20 min后，取上清液用PB緩沖液稀釋3倍，并與5×loading buffer按4:1體積比混合，在沸水浴中放置5 min，取4 μL進(jìn)行SDS-PAGE分析。經(jīng)染色脫色儀10 min工作程序處理后，在凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果。采用圖像處理軟件ImageJ 1.54f對(duì)SDS-PAGE圖像進(jìn)行Rolling ball算法[28]背景校正后取反色，進(jìn)行目的蛋白表達(dá)量的半定量灰度分析。
表達(dá)水平與酶活數(shù)據(jù)包含3個(gè)生物學(xué)平行重復(fù)組，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間顯著差異分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，使用Waller-Duncan多重比較法進(jìn)行差異檢測(cè)。顯著性水平設(shè)定為P<0.05，所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 27.0軟件完成。

1.5 鹵醇脫鹵酶催化1,3-DCP合成手性環(huán)氧氯丙烷

1.5.1 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件
在20 mL Gly/NaOH緩沖液(600 mmol/L, pH 9.8)與乙酸乙酯體積比為1:1的反應(yīng)體系中加入含鹵醇脫鹵酶突變體的重組菌0.2 g (終濃度為10 g/L)，400 mmol/L 1,3-DCP，于30 ℃孵育10 min后，180 r/min水浴振蕩反應(yīng)5 min后取樣，12 000 r/min離心1 min，取上層有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉處理后進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。
1.5.2 氣相檢測(cè)方法
底物1,3-DCP與產(chǎn)物環(huán)氧氯丙烷(epichlorohydrin, ECH)使用GC (Agilent公司)進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)條件如下：色譜柱型號(hào)為BGB-175手性毛細(xì)管柱(0.25 mm×30 m×0.25 μm)；柱箱條件為初始柱溫100 ℃，保持4 min后以2 ℃/min升溫至110 ℃，而后以30 ℃/min升高至180 ℃，保持3 min。進(jìn)樣口溫度設(shè)定為250 ℃，F(xiàn)ID檢測(cè)口溫度設(shè)定為250 ℃。載氣為高純氮，流量設(shè)定為1.5 mL/min，分流比為80:1。

2 結(jié)果與分析

2.1 5′mRNA序列設(shè)計(jì)

基于翻譯起始區(qū)TIR中5′mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與目標(biāo)蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)的研究結(jié)論[5-8]，本研究通過(guò)降低mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以提高翻譯起始效率，對(duì)HheC編碼序列的5′mRNA序列進(jìn)行優(yōu)化，從而增加HheC表達(dá)。在不改變氨基酸序列的前提下，分別以提高和降低ΔG為目標(biāo)對(duì)序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并設(shè)計(jì)相應(yīng)引物對(duì)5′mRNA核苷酸序列進(jìn)行突變。其中，2號(hào)位丙氨酸插入突變ins2A為實(shí)驗(yàn)中意外所得，上標(biāo)為相應(yīng)密碼子編碼的丙氨酸，其余序列均編碼與HheCM4相同的氨基酸。
以起始密碼子上游不同位點(diǎn)作為最小折疊自由能預(yù)測(cè)的起始位點(diǎn)均能得到相近的自由能預(yù)測(cè)結(jié)果(R2=0.938 5)[29]。因此，本研究以起始密碼子(AUG) 80 nt的序列(-20-60)作為研究對(duì)象，預(yù)測(cè)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)并計(jì)算自由能。如表2所示，不同密碼子對(duì)應(yīng)的2號(hào)位丙氨酸插入突變體與出發(fā)酶HheCM4相比，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)確實(shí)存在折疊自由能差異。由此，設(shè)計(jì)預(yù)期mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低的高表達(dá)突變體HheCM4/H1 (ΔG=-13.20 kcal/mol)與HheCM4/H2 (ΔG=-12.00 kcal/mol)，同時(shí)設(shè)計(jì)預(yù)期高穩(wěn)定性低表達(dá)的突變體HheCM4/L1 (ΔG=-21.70 kcal/mol)與HheCM4/L2 (ΔG=-24.10 kcal/mol)用于反向驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步表征了對(duì)應(yīng)突變體在宿主中的表達(dá)水平。

表2   5′mRNA序列設(shè)計(jì)Table 2   Design of synonymous mutation sequences of 5′mRNA

a：下劃線代表起始密碼；b：源于ViennaRNA；c：源于Mfold。

a: The underline represents the start codon; b: Calculated by ViennaRNA; c: Calculated by Mfold.


2.2 目標(biāo)蛋白表達(dá)水平與催化活性研究

SDS-PAGE圖像與灰度掃描半定量分析結(jié)果如圖1所示，出發(fā)株HheCM4中HheC (28.7 kDa)占宿主細(xì)胞中可溶性蛋白的比例為16.71%。4種插入突變體中，ins2AGCA表達(dá)水平變化不顯著(16.61%)，而ins2AGCU、ins2AGCC、ins2AGCG表達(dá)水平提升幅度相近，HheC占比分別為25.42%、27.36%與26.71%。序列設(shè)計(jì)結(jié)果中具有更高mRNA穩(wěn)定性的HheCM4/L2 (12.38%)表達(dá)水平低于HheCM4/L1 (14.98%)，且較出發(fā)株均有所下降；而具有更低穩(wěn)定性的HheCM4/H2 (33.39%)表達(dá)水平高于HheCM4/H1 (31.78%)，較出發(fā)株提升顯著，與設(shè)計(jì)預(yù)期一致。
圖1   HheCM4及其突變體的表達(dá)水平Figure 1   Expression levels of HheCM4 and its mutants. A: SDS-PAGE analysis chart of HheCM4 and its mutants (Lane 1: Protein marker; Lane 2: HheCM4; Lane 3: ins2AGCA; Lane 4: ins2AGCU; Lane 5: ins2AGCC; Lane 6: ins2AGCG; Lane 7: HheCM4/L1; Lane 8: HheCM4/L2; Lane 9: HheCM4/H1; Lane 10: HheCM4/H2); B: Comparison of the soluble expression of HheCM4 and its mutants [Different lowercase letters indicate that there are significant differences in the expression level among different strains (P<0.05)].
HheCM4及其突變體的全細(xì)胞催化活性測(cè)定結(jié)果如圖2所示，與表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果對(duì)應(yīng)，4種插入突變體中ins2AGCA具有最低的催化活性，較出發(fā)株HheCM4不存在顯著變化，而其余3種插入突變體催化活性均有顯著提升。序列設(shè)計(jì)結(jié)果中具有高mRNA穩(wěn)定性的HheCM4/L1與HheCM4/L2相對(duì)酶活均不及出發(fā)株，且具有更低ΔG的HheCM4/L2 (57.95%)催化活性低于HheCM4/L1 (72.18%)；而mRNA穩(wěn)定性更低的HheCM4/H1 (278.85%)與HheCM4/H2 (300.78%)催化活性均存在顯著提升，且具有最高ΔG的HheCM4/H2表現(xiàn)出最高的催化活性，與表達(dá)水平以及mRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性預(yù)測(cè)結(jié)果一致。
圖2   HheCM4及其突變體的相對(duì)酶活比較Figure 2   Comparison of the relative enzyme activities of HheCM4 and its mutants. Different lowercase letters indicate that there are significant differences in the relative activity among different strains (P<0.05).
基于HheC表達(dá)水平與ΔG相關(guān)性繪制的散點(diǎn)圖如圖3所示。采用2種不同算法工具得到的ΔG結(jié)果均反映mRNA熱力學(xué)穩(wěn)定性與HheC表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性，即隨著自由能ΔG的升高(mRNA穩(wěn)定性降低) HheC表達(dá)量顯著增加，且2種算法的預(yù)測(cè)結(jié)果在分布趨勢(shì)與數(shù)據(jù)密度上基本一致。
圖3   mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊自由能(ΔG)與HheC表達(dá)水平相關(guān)性分析Figure 3   Correlation analysis of the folding free energy (ΔG) of mRNA secondary structure and the expression level of HheC.

2.3 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

MFE結(jié)構(gòu)是依據(jù)自由能最小化原則得到的、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的構(gòu)象，代表了熱力學(xué)上最可能形成的結(jié)構(gòu)。質(zhì)心結(jié)構(gòu)(centroid structure)是通過(guò)概率模型計(jì)算所得的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，表示熱力學(xué)構(gòu)象集合中最接近平均構(gòu)象的一種代表性結(jié)構(gòu)[30]。
源于ViennaRNA的5′mRNA MFE二級(jí)結(jié)構(gòu)與質(zhì)心二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4所示。基于熵值對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行著色，反映了mRNA在該位置存在不同構(gòu)象的可能性。熵值趨于0 (暖色調(diào))表明該位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定，可形成多種不同構(gòu)象，如環(huán)或單鏈結(jié)構(gòu)；熵值趨于冷色調(diào)則表明該位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，通常位于莖(stem)結(jié)構(gòu)中，更易于配對(duì)并形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。HheCM4二級(jí)結(jié)構(gòu)的大部分區(qū)域形成了一個(gè)緊湊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，且MFE結(jié)構(gòu)與質(zhì)心結(jié)構(gòu)具有較高的相似性(圖4A)，表明該結(jié)構(gòu)具有一定程度的穩(wěn)定性。HheCM4/H1 (圖4H)與HheCM4/H2 (圖4I)的MFE結(jié)構(gòu)與質(zhì)心結(jié)構(gòu)相似度較低，存在更多不穩(wěn)定的非配對(duì)結(jié)構(gòu)，因而易于解旋，有助于核糖體快速結(jié)合，通過(guò)提高翻譯效率增加HheC表達(dá)量。相比之下，HheCM4/L1 (圖4F)與HheCM4/L2 (圖4G)的MFE結(jié)構(gòu)與質(zhì)心結(jié)構(gòu)均呈高度相似的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，表明兩者具有高度穩(wěn)定的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而通過(guò)阻礙翻譯起始降低HheC表達(dá)量。
圖4   ViennaRNA mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Figure 4   Prediction of mRNA structure by ViennaRNA. A: HheCM4; B: ins2AGCA; C: ins2AGCU; D: ins2AGCC; E: ins2AGCG; F: HheCM4/L1; G: HheCM4/L2; H: HheCM4/H1; I: HheCM4/H2.
源于Mfold的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5所示。由于Mfold輸出的mRNA結(jié)構(gòu)僅包括MFE結(jié)構(gòu)或熱力學(xué)能量接近MFE的次優(yōu)結(jié)構(gòu)，因此大多呈現(xiàn)為相似度較高的連續(xù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。HheCM4 (圖5A)存在多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，雙鏈配對(duì)區(qū)域較為集中；ins2AGCA (圖5B)結(jié)構(gòu)與其高度相似，配對(duì)密度略低；而ins2AGCU (圖5C)、ins2AGCC (圖5D)、ins2AGCG (圖5E)三者結(jié)構(gòu)高度相似，發(fā)夾短，環(huán)結(jié)構(gòu)分布更多，配對(duì)密度更低。HheCM4/L1 (圖5F)與HheCM4/L2 (圖5G)存在連續(xù)且緊密的長(zhǎng)莖結(jié)構(gòu)，雙鏈配對(duì)密度顯著提升。HheCM4/H1 (圖5H)雖與HheCM4同樣具有較高的相似度，但配對(duì)密度進(jìn)一步下降，HheCM4/H2 (圖5I)則僅在少量堿基間形成較短的配對(duì)。

圖5   Mfold mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Figure 5   Prediction of mRNA structure by Mfold. A: HheCM4; B: ins2AGCA; C: ins2AGCU; D: ins2AGCC; E: ins2AGCG; F: HheCM4/L1; G: HheCM4/L2; H: HheCM4/H1; I: HheCM4/H2.
源于UFold的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖6所示。HheCM4 (圖6A)主鏈存在連續(xù)的莖區(qū)雙鏈配對(duì)，而插入突變體(圖6B-6E)莖區(qū)長(zhǎng)度降低，主鏈存在更多環(huán)結(jié)構(gòu)。HheCM4/L1 (圖6F)與HheCM4/L2 (圖6G)存在更長(zhǎng)的莖區(qū)和更致密的堿基配對(duì)，且在HheCM4/L2中尤為顯著。相比之下，HheCM4/H2 (圖6I)配對(duì)結(jié)構(gòu)少，莖區(qū)結(jié)構(gòu)較短，發(fā)夾未完全閉合，同時(shí)更復(fù)雜的長(zhǎng)程相互作用表明其存在更大的三維構(gòu)象自由度。
圖6   UFold mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Figure 6   Prediction of mRNA structure by UFold. A: HheCM4; B: ins2AGCA; C: ins2AGCU; D: ins2AGCC; E: ins2AGCG; F: HheCM4/L1; G: HheCM4/L2; H: HheCM4/H1; I: HheCM4/H2.

2.4 熱力學(xué)性質(zhì)分析

山形圖(mountain plot)能夠基于mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的MFE結(jié)構(gòu)自由能、質(zhì)心結(jié)構(gòu)自由能以及配對(duì)(partition function, PF)結(jié)構(gòu)展現(xiàn)序列特定區(qū)域的自由能變化。如圖7所示，HheCM4/L1 (圖7F)與HheCM4/L2 (圖7G)的三條曲線高度相似，且HheCM4/L2的MFE與Centroid曲線完全重合，這進(jìn)一步證明了其mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)具有高度穩(wěn)定性。HheCM4/H1 (圖7H)與HheCM4/H2 (圖7I)相較于HheCM4 (圖7A)自由能更低，并且HheCM4/H2中存在一個(gè)顯著的低能量區(qū)域，這或許更有利于mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的部分解旋。

圖7   mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)山形圖Figure 7   Mountain plot of mRNA secondary structure. A: HheCM4; B: ins2AGCA; C: ins2AGCU; D: ins2AGCC; E: ins2AGCG; F: HheCM4/L1; G: HheCM4/L2; H: HheCM4/H1; I: HheCM4/H2.
熵(entropy)是量化二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變化的一個(gè)重要參數(shù)，可用于衡量mRNA不同區(qū)域的結(jié)構(gòu)可變程度。低熵表示該位置的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，構(gòu)象選擇性低，在大多數(shù)情況下均能折疊成特定結(jié)構(gòu)；而高熵值則相反，表明二級(jí)結(jié)構(gòu)高度動(dòng)態(tài)，構(gòu)象變化較多。通過(guò)對(duì)各突變體的mRNA序列進(jìn)行熵值分析能夠進(jìn)一步揭示它們之間二級(jí)結(jié)構(gòu)的可變性和動(dòng)態(tài)特性。HheCM4、HheCM4/L1、HheCM4/L2中存在更多的低熵區(qū)域，表明其大部分區(qū)域構(gòu)象變化受限；而HheCM4/H1、HheCM4/H2中熵普遍較高，表明其二級(jí)結(jié)構(gòu)在多個(gè)區(qū)域存在較大的可變空間。

2.5 高表達(dá)HheC催化1,3-DCP合成ECH反應(yīng)進(jìn)程

本研究考察了HheCM4及其突變體(5 g/L濕細(xì)胞)催化100 mmol/L底物合成ECH的反應(yīng)進(jìn)程，結(jié)果如圖8所示。受限于鹵醇脫鹵酶的可逆反應(yīng)，在該體系下的最大產(chǎn)率僅能達(dá)到約88%。HheCM4/H1與HheCM4/H2反應(yīng)5 min時(shí)產(chǎn)率即可分別達(dá)到14.31%與17.17%，且僅需約50 min即可達(dá)到最大產(chǎn)率；而出發(fā)株HheCM4反應(yīng)5 min時(shí)產(chǎn)率僅為7.54%，達(dá)到同一水平產(chǎn)率需將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至約120 min。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中本研究的高表達(dá)突變體能夠有效加速反應(yīng)進(jìn)程，在現(xiàn)有體系下完成底物的高效轉(zhuǎn)化，縮短生產(chǎn)周期，為鹵醇脫鹵酶高效催化1,3-DCP合成ECH奠定重要基礎(chǔ)。
圖8   HheCM4及其突變體催化1,3-DCP合成ECH的反應(yīng)進(jìn)程Figure 8   Synthesis of ECH from 1,3-DCP catalyzed by HheCM4 and its mutants.

3 討論與結(jié)論

鹵醇脫鹵酶作為一種能夠催化鹵代醇與環(huán)氧化物相互轉(zhuǎn)化的生物催化劑，在環(huán)境修復(fù)與監(jiān)測(cè)[31-32]、合成藥物手性中間體[3-4]等領(lǐng)域均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。另一方面，原核生物的基因表達(dá)受mRNA結(jié)構(gòu)的影響。在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，翻譯起始是其中限速且受調(diào)控程度最高的階段[11]，易受到mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。穩(wěn)定的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)阻礙核糖體30S亞基與RBS的結(jié)合，從而抑制翻譯起始，顯著影響目的基因的表達(dá)[9,16-17]，而較低的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有利于兩者結(jié)合，進(jìn)而高效啟動(dòng)翻譯[33-35]。因此，通過(guò)序列優(yōu)化降低翻譯起始區(qū)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性能夠有效提高翻譯起始效率，實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主細(xì)胞中的高效表達(dá)。
本研究基于鹵醇脫鹵酶HheC編碼序列5′端mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與折疊自由能，借助mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具進(jìn)行計(jì)算，在維持氨基酸序列不變的前提下實(shí)現(xiàn)了核苷酸序列的優(yōu)化。最終，使HheC在E. coli BL21(DE3)中的表達(dá)水平由占宿主細(xì)胞可溶性蛋白的16.71%提升至33.39%，相對(duì)酶活提升至原來(lái)的3倍。此外，通過(guò)負(fù)向優(yōu)化得到的高穩(wěn)定性5′mRNA序列表現(xiàn)出低表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證了HheC 5′mRNA穩(wěn)定性與其表達(dá)水平的相關(guān)性。將所得成果應(yīng)用于催化1,3-DCP合成ECH，在本研究體積比為1:1的Gly/NaOH (600 mmol/L, pH 9.8)與乙酸異丁酯的雙相體系下，高表達(dá)HheC通過(guò)濕細(xì)胞催化100 mmol/L 1,3-DCP合成ECH達(dá)到產(chǎn)率上限的反應(yīng)時(shí)間由120 min縮短至50 min。HheC的高效表達(dá)不僅能夠提高目標(biāo)酶的產(chǎn)量，使微量活性差異更易被檢測(cè)與量化，從而提升蛋白質(zhì)工程中突變篩選的靈敏度和效率；而且對(duì)于生產(chǎn)應(yīng)用而言，更易于實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系的高效催化，顯著提高經(jīng)濟(jì)效益，降低生產(chǎn)成本，增強(qiáng)酶催化工藝路線的競(jìng)爭(zhēng)力。

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