水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定——液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（二）
2.4 樣品制備
2. 4. 1 鮮活水產(chǎn)品
2.4.1. 1 提取
稱取5.00 g已搗碎樣品于50 mL離心管中，加入200 μL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液(2. 2. 19)，加入11 mL 乙腈，超聲波振蕩提取2 min，8 000 r/min勻漿提取30 s，4 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL 比色管中；另取一 50 mL離心管加入11 mL乙腈，洗滌勻漿刀頭10 s，洗滌液移入前一離心管中，用玻棒搗碎離心管中的沉淀，渦旋振蕩器上振蕩30 s，超聲波振蕩5 min，4 000 r/min離心5 min，上清液合并至 25 mL比色管中，用乙腈定容至25.0 mL，搖勻備用。
2.4.1.2 凈化
移取5. 00 mL樣品溶液加至已活化的中性氧化鋁柱(2. 2.14)上，用KD濃縮瓶接收流出液，4 mL乙腈洗滌中性氧化鋁柱，收集全部流出液，45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL，殘液用乙腈定容至1.00 mL，超聲波振 蕩5 min，加入1. 0 mL 5 mmol/L乙酸銨，超聲波振蕩1 min，樣液經(jīng)0. 2呻濾膜過濾后供液相色譜-串 聯(lián)質(zhì)譜測定。
2.4.2 加工水產(chǎn)品
2. 4. 2. 1 提取
稱取5.00 g已搗碎樣品于100 mL離心管中，加入200μL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液(2. 2. 19)，依次加入 1 mL鹽酸羥胺(2. 2. 9)，2 mL對-甲苯磺酸(2. 2. 10).2 mL乙酸銨緩沖溶液(2.2.6)和40 mL乙腈，勻 漿2 min(10 000 r/min)，離心3 min(3 000 r/min)，將上清液轉(zhuǎn)移到250 mL分液漏斗中，用20 mL乙腈重復(fù)提取殘渣一次，合并上清液。于分液漏斗中加入30 mL二氯甲烷、35 mL水，振搖2 min，靜置分 層，收集下層有機層于150 mL梨形瓶中，再用20 mL二氯甲烷萃取一次，合并二氯甲烷層，45°C旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)近干。
2.4.2.2 凈化
將中性氧化鋁柱(2. 2. 14)串接在陽離子交換柱(2. 2. 13)±方。用6 mL乙腈分3次(每次2 mL)，用 渦旋振蕩器渦旋溶解上述提取物，并依次過柱，控制陽離子交換柱流速不超過0.6mL/mm，再用2 mL乙腈淋洗中性氧化鋁柱后，棄去中性氧化鋁柱。依次用3 mL體積分?jǐn)?shù)為2%的甲酸溶液、3 mL乙腈淋洗陽 離子交換柱，棄去流出液。用4 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的乙酸銨甲醇溶液(2. 2.12)洗脫，洗脫流速為 1 mL/min，用10 mL刻度試管收集洗脫液，用水定容至10. 0 mL，樣液經(jīng)0. 2μm 濾膜過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。
2.5 測定
2.5. 1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件
a） 色譜柱:C18柱，50 mmX2.1 mm（內(nèi)徑），粒度3μm；
b） 流動相：乙腈+5 mmol/L乙酸銨= 75+25（體積比）；
c） 流速：0. 2 mL/min；
d） 柱溫：35°C；
e） 進樣量：10 μL；
f） 離子源：電噴霧ESI，正離子；
g） 掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；
h） 霧化氣、窗簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮氣，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求；
i） 噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能等電壓值應(yīng)優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度；
j） 監(jiān)測離子對:孔雀石綠m/z 329/313（定量離子）.329/208；隱色孔雀石綠m/z 331/316（定量離子），331/239；結(jié)晶紫m/z 372/356（定量離子），372/251；隱色結(jié)晶紫m/z 374/359（定量 離子）、374/238；氘代孔雀石綠m/z 334/318（定量離子）；氘代隱色孔雀石綠m/z 337/322（定 量離子）。
2.5.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定
按照2. 5. 1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測定樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（2. 2. 20），以色譜峰面積按內(nèi)標(biāo)法 定量，孔雀石綠和結(jié)晶紫以氘代孔雀石綠為內(nèi)標(biāo)物計算，隱色孔雀石綠和隱色結(jié)晶紫以氘代隱色孔雀石綠 為內(nèi)標(biāo)物計算。在上述色譜條件下孔雀石綠、氘代孔雀石綠、結(jié)晶紫、氘代隱色孔雀石綠、隱色孔雀石綠和 隱色結(jié)晶紫的參考保留時間分別為2. 27 min、2. 30 min，2. 88 min、5.21 min，5. 31 min、5. 61 min，標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子流圖參見附錄A中圖A. 1。
2.5.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證
按照2. 5.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別計算樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中非定量離子對與定量離子對色譜峰面積的比值，僅當(dāng)兩者數(shù)值的相對偏差小于25%時方可確定兩者為同一物質(zhì)。
2.6 空白試驗
除不加試樣外，均按2. 4、2. 5步驟進行。
2.7 結(jié)果計算和表述
按式（1）計算樣品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫和隱色結(jié)晶紫殘留量。計算結(jié)果需扣除空白值。
式中：
X——樣品中待測組分殘留量，單位為微克每千克（μg/kg）；
c ——孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫或隱色結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度，單位為微克每升（μg/L）；
Csi——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，單位為微克每升（μg/L）；
Ci——樣液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，單位為微克每升（μg/L）；
As——孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫或隱色結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積；
A ——樣液中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫或隱色結(jié)晶紫的峰面積；
Asi——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；
Ai——樣液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；
V ——樣品定容體積，單位為毫升（mL）；
m——樣品稱樣量，單位為克（g）。
本方法孔雀石綠的殘留量測定結(jié)果系指孔雀石綠和它的代謝物隱色孔雀石綠殘留量之和，以孔雀石綠表示。
本方法結(jié)晶紫的殘留量測定結(jié)果系指結(jié)晶紫和它的代謝物隱色結(jié)晶紫殘留量之和，以結(jié)晶紫表示
2.8 方法檢測限
本方法孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫的檢測限均為0. 5μg/kg。
文章來源：《水產(chǎn)品獸藥殘留限量及監(jiān)測方法查詢手冊》
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