水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定——離效液相色譜法
3 離效液相色譜法
3.1 原理
試樣中的殘留物用乙腈-乙酸鹽緩沖混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷層并濃縮，經酸性氧化鋁柱凈化后，高效液相色譜-二氧化鉛柱后衍生測定，外標法定量。
3.2 試劑和材料
除另有規定外，試劑均為分析純，水為重蒸餾水。
3.2.1 乙腈：液相色譜純。
3.2.2 二氯甲烷。
3.2.3 甲醇：液相色譜純。
3.2.4 乙酸鹽緩沖液：溶解4.95g無水乙酸鈉及0.95g對-甲苯磺酸于950mL水中，用冰乙酸調節溶液pH到4.5，最后用水稀釋到1L。
3.2.5 20%鹽酸羥胺溶液。
3.2.6 1.0mol/L對-甲苯磺酸：稱取17.2g對-甲苯磺酸，并用水稀釋至100mL。
3.2.7 50mmol/L乙酸銨緩沖溶液：稱取3.85g無水乙酸銨溶解于1000mL水中，冰乙酸調pH到4.5。
3.2.8 二甘醇。
3.2.9 酸性氧化鋁：80目?120目。
3.2.10 二氧化鉛。
3.2.11 硅藻土545：色譜層析級。
3.2.12 標準品：孔雀石綠（MG）、隱色孔雀石綠（LMG）、結晶紫（CV）、隱色結晶紫（LCV），純度大于98%。
3.2.13 標準溶液：準確稱取適量的孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫，用乙腈分別配制成100Mg/mL的標準儲備液，再用乙腈稀釋配制1μg/mL的標準溶液。一18°C避光保存。
3.2.14 混合標準工作溶液：用乙腈稀釋標準溶液（3.2.13），配制成每毫升含孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫均為20ng的混合標準溶液。一18°C避光保存。
3.3 儀器和設備
3.3.1 高效液相色譜儀：配有紫外-可見光檢測器。
3.3.2 勻漿機。
3.3.3 離心機：4000r/min。
3.3.4 固相萃取裝置。
3.3.5 25%二氧化鉛氧化柱：不銹鋼預柱管［5cmX4mm（內徑）］，兩端附2μm過濾板，抽真空下，填裝含有25%二氧化鉛的硅藻土，添加數滴甲醇壓實，旋緊。臨用前用甲醇沖洗。并將二氧化鉛氧化柱連接在紫外-可見光檢測器與液相色譜柱之間。
3.3.6 酸性氧化鋁柱：1g/3mL，使用前用5mL乙腈活化。
3.4 樣品制備
3.4.1 提取
稱取5.00g樣品于50mL離心管內，加入1.5mL20%的鹽酸羥胺溶液，2.5mL1.0mol/L的對-甲苯磺酸溶液、5.0mL乙酸鹽緩沖溶液，用勻漿機以10000r/min的速度均質30s，加入10mL乙腈劇烈振搖30s。加入5g酸性氧化鋁，再次振蕩30s。3000r/min離心10mm。把上清液轉移至裝有10mL水和2mL二甘醇的100mL離心管中。然后在50mL離心管中加入10mL乙腈，重復上述操作，合并乙腈層。
3.4.2 凈化
在離心管中加入15mL二氯甲烷，振蕩10s，3000r/min離心10min，將二氯甲烷層轉移至100mL的梨形瓶中，再用5mL乙腈、10mL二氯甲烷重復上述操作一次，合并二氯甲烷層于100mL梨形瓶中。45°C旋轉蒸發至約1mL，用2.5mL乙腈溶解殘渣。
將酸性氧化鋁柱（3.3.6）安裝在固相萃取裝置上，將梨形瓶中的溶液轉移到柱上，再用乙腈洗滌瓶2次，每次2.5mL，把洗滌液依次通過柱，控制流速不超過0.6mL/min，收集全部流出液，45°C旋轉蒸發至近干，殘液準確用0.5mL乙腈溶解，過0.45濾膜，濾液供液相色譜測定。
3.5 測定
3.5.1 液相色譜條件
a） 色譜柱：C18柱，250mmX4.6mm（內徑），粒度5μm，在C18色譜柱和檢測器之間連接25%二氧化鉛氧化柱；
b） 流動相：乙腈和乙酸銨緩沖溶液（3.2.7），梯度洗脫參數見表1；
c） 流速：1.0mL/min；
d） 柱溫：室溫；
e） 檢測波長：618nm（孔雀石綠），588nm（結晶紫）；
f） 進樣量：50μL。
3.5.2 液相色譜測定
根據樣液中被測孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫或隱色結晶紫含量情況，選定峰高相近的標準工作溶液。標準工作溶液和樣液中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫和隱色結晶紫響應值均應在儀器檢測線性范圍內。對標準工作溶液和樣液等體積參插進樣測定。在上述色譜條件下，孔雀石綠、結晶紫、隱色孔雀石綠和隱色結晶紫的保留時間約為6.10min，7.88min、17.77min、18.22min，標準品色譜圖參見附錄A中圖A.2。
3.6 空白試驗
除不加試樣外，均按3.4，3.5步驟進行。
3.7 結果計算和表述
按式（2）計算樣品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫和隱色結晶紫殘留量。計算結果需扣除空白值。
式中：
X——樣品中待測組分殘留量，單位為毫克每千克(mg/kg)；
c—待測組分標準工作液的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL)；
A——樣品中待測組分的峰面積；
As——待測組分標準工作液的峰面積；
V——樣液最終定容體積，單位為毫升(mL)；
m——最終樣液所代表的試樣量，單位為克(g)。
本方法孔雀石綠的殘留量測定結果系指孔雀石綠和它的代謝物隱色孔雀石綠殘留量之和，以孔雀石綠表示。
本方法結晶紫的殘留量測定結果系指結晶紫和它的代謝物隱色結晶紫殘留量之和，以結晶紫表示。
3.8 方法檢測限
本方法孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫的檢測限均為2.0μg/kg。
文章來源：《水產品獸藥殘留限量及監測方法查詢手冊》
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