在微生物鑒定中，革蘭氏染色應(yīng)該是最初接觸的一種區(qū)分細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)方法。通過革蘭氏染色鑒定后，區(qū)分出革蘭氏陽性菌和陰性菌，憑借結(jié)果以作后續(xù)的鑒定分離細(xì)菌。可以說，革蘭氏染色在微生物研究過程中，是一個(gè)應(yīng)該掌握的技術(shù)。

要了解革蘭氏染色的原理，先了解細(xì)菌的細(xì)胞壁：

細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成，能夠固定細(xì)胞外形和保護(hù)細(xì)胞不受損傷，其主要功能包括：

• 特定的抗原性以及抵御抗生素、噬菌體的能力；

• 固定細(xì)胞外形以及提高機(jī)械強(qiáng)度，避免外力的損傷；

• 是細(xì)胞生長、分裂和運(yùn)動（主要是有鞭毛的細(xì)菌）的必需構(gòu)造；

• 阻擋大分子物質(zhì)（對生命活動有危害或潛在危害的物質(zhì)）進(jìn)入細(xì)胞。

細(xì)菌細(xì)胞壁除了含有肽聚糖，還有其它組分，這些組分是革蘭氏陽性菌和陰性菌所不同的。

革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁主要由60%-95%的肽聚糖組成，還有10%-30%磷壁酸；陰性菌的細(xì)胞壁與陽性菌細(xì)胞壁相比較，厚度相對薄，并且成分復(fù)雜，除了肽聚糖外，還有一層由脂多糖、磷脂和若干外膜蛋白組成的外膜結(jié)構(gòu)。

革蘭氏陽性菌與陰性菌細(xì)胞壁的主要差異如下：

• 肽聚糖層：陽性菌的較厚且層次多，陰性菌的為單層且薄；

• 外膜：只有陰性菌存在外膜結(jié)構(gòu)，包括了脂多糖和類脂；

• 磷壁酸：多數(shù)陽性菌都有磷壁酸，陰性菌不存在磷壁酸；

• 對機(jī)械力的抗性：陽性菌抗機(jī)械力的能力強(qiáng)于陰性菌；

• 抗溶菌酶的能力：陰性菌抗溶菌酶的能力優(yōu)于陽性菌。

  
  

革蘭氏染色以細(xì)菌細(xì)胞壁化學(xué)成分的差異引起脫色能力的不同為基礎(chǔ)，即，細(xì)菌能否將染色劑阻礙在細(xì)胞壁中的原理，進(jìn)行區(qū)分陽性菌和陰性菌，其結(jié)果為：陽性菌的細(xì)胞壁能夠?qū)⑷旧珓┙Y(jié)晶紫阻留而染成紫色；陰性菌的細(xì)胞壁不能將染色劑阻留，經(jīng)過復(fù)染后形成紅色。

經(jīng)過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，該復(fù)合物不溶于水。陽性菌因?yàn)榧?xì)胞壁較厚、肽聚糖層多和交聯(lián)致密，且不含類脂，當(dāng)乙醇/丙酮進(jìn)行脫色處理時(shí)，肽聚糖網(wǎng)層結(jié)構(gòu)因失水導(dǎo)致網(wǎng)孔變小，結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物就被阻留在細(xì)胞壁中。

陰性菌因?yàn)榧?xì)胞壁較薄，且外膜層類脂物質(zhì)含量高，受到乙醇/丙酮作用，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，外膜的類脂溶解，肽聚糖網(wǎng)層不能夠?qū)⒔Y(jié)晶紫與碘的復(fù)合物阻留，重新恢復(fù)為無色的狀態(tài)，然后經(jīng)過沙黃等紅色染劑的復(fù)染形成紅色。

革蘭氏染色的基本步驟如下：

1.  固定：涂片干后加熱固定，火焰固定時(shí)涂片膜朝上，以中等速度越過火焰3次，或使用乙醇/甲醇固定；

2. 初染：滴加結(jié)晶紫染液，1分鐘，清水洗去染液；

3. 媒染：加碘液，1分鐘，水洗；

4. 脫色：加脫色液，搖動10-30秒，至無紫色脫落，水洗；

5. 復(fù)染：加復(fù)染液，30秒，水洗；

6. 鏡檢：涂片干后鏡檢。