堿性磷酸酶(AKP)米氏常數(shù)(km)的測定
原理：
當(dāng)環(huán)境的溫度、pH和酶濃度等條件一定時，酶促反應(yīng)的初速度(V)隨底物濃度[S]增高而加快，直到達(dá)到一個極限，即最大反應(yīng)速度(V)。底物濃度與酶反應(yīng)初速度的這種關(guān)系，米一曼(Michaelis—Menten)氏推導(dǎo)出如下公式，稱為米—曼氏方程式：
式中Km稱為米式常數(shù)。Km是反應(yīng)速度等于最大反應(yīng)速度一半（v=V/2）時底物的濃度。Km是酶的特征性常數(shù)。測定Km是研究酶動力學(xué)的一種主要方法。林一貝(Lineweaver—Burk)氏根據(jù)米—曼氏方程式又推導(dǎo)如下方程式：
以不同的底物濃度1/[S]為橫坐標(biāo)1/v為縱坐標(biāo)，按直線回歸方程計算，作圖，并向縱軸方向延長，此線在橫軸上截距為1/Km的負(fù)值。
本實驗以堿性磷酸酶為例，選擇不同濃度的磷酸苯二鈉為其底物，磷酸苯二鈉被AKP水解后，生成酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4—氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌的衍生物，根據(jù)紅色的深淺可測出酶活力高低，其反應(yīng)式如下
儀器 ：
中號試管 18支 恒溫水浴
刻度移液管 8支 721分光光度計
比色杯
試劑 ：
1．底物液(10mmol/l，磷酸苯二鈉)
稱磷酸苯二鈉(C 6 H 5 Na 2 PO 4 ·2H 2 O) 2．54克或磷酸苯二鈉(無結(jié)晶水)2．18克，用煮沸冷卻蒸餾水溶解并稀釋至1000ml，加4ml氯仿防腐，棕色瓶4℃保存，一周內(nèi)使用。
2．緩沖液(0．1mol/L磷酸鹽緩沖液，pHl0．0)
無水碳酸鈉6．36克及磷酸氫鈉3．36克，溶于蒸餾水800ml，再加蒸餾水定量至1000ml。
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