離心分離方法專題介紹
在實驗過程中，由于樣品的各種性質(zhì)差異，只有選擇了正確的離心方法，才能獲得預(yù)期的分離純化結(jié)果。常用的離心方法主要有差速離心法、密度梯度離心法。其中密度梯度離心法又可細(xì)分為速率區(qū)帶離心和等密度梯度離心法。小貝離心學(xué)堂將對這三種常用的離心分離方法分別進行專題介紹。
離心方法——差速離心
差速離心法 (differebtial velocity centrifugation method) 又稱離心力差分離法。原理是利用樣品中各組分沉降系數(shù)的差異，對不同的微粒施以不同的離心力，經(jīng)過多次離心，離心速度逐步加大，將不同的微粒依次沉降，從而實現(xiàn)離心分離。如果分離樣品中有大中小三種不同粒徑的微粒，對它們施以不同的離心力，大粒徑的微粒，其質(zhì)量較大，首先沉降。
分離上清液，以更大轉(zhuǎn)速對上清液進行第二次離心，中顆粒被分離出來。再取上清以更大離心力，更高的轉(zhuǎn)速，最后沉降小顆粒，以達到不同顆粒的分離。由于在每種顆粒的沉淀物中總含有部分次級顆粒，如想將某種顆粒提純，需對該顆粒的沉淀物進行稀釋后再離心沉淀，最終可制備出理想純度的顆粒。
由于小粒徑的微粒質(zhì)量小，分離時所需離心力大。為滿足大離心力的需要，必需提高其旋轉(zhuǎn)速度，方可分離。以不同的離心力分離不同粒徑的微粒是動力學(xué)的分離方法。特別是沉降速度差別較大的微粒多采用此種分離方法。差速離心原理可用離心力表達式說明。F=ma 其中 a=ω2R
差速離心主要用于分離直徑和密度差異較大的顆粒。差速離心法的優(yōu)點是分離時間短、重復(fù)性高，樣品處理量大，可用于大量樣品的初分離。其缺點是分離復(fù)雜樣品和要求分離純度較高時，離心次數(shù)多，操作繁雜。由于沉淀的多次清洗、溶解、再沉淀，容易引起中間損失，所以離心分辨力差。實際分離時由于離心時的對流、擴散和收取沉淀時的污染，對于一些沉降系數(shù)相差不大的組分無法進行完全的分離提純。樣品的純度和回收率都不理想，因此差速離心法主要用于大量樣品的初步分離提純。
例如，我們可以對動物肝組織勻漿液進行多次的不同相對離心力和時間的離心和沉淀/上清分步收集，得到樣品的細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和核糖體等的初步分離富集沉淀，用于下一步的其他檢測或者精細(xì)純化實驗。具體的處理流程如下：
離心方法——速率區(qū)帶離心法
密度梯度離心（isodensity centrifugation method）又稱為區(qū)帶離心。離心時先將樣品溶液置于一個由惰性梯度材料形成的密度梯度液體柱中，離心后被分離組分以區(qū)帶層分布于梯度柱中。該方法的優(yōu)點是可以同時使樣品中幾種或全部組分分離，具有良好的分辨率，分離效果好，可一次獲得較純組分。
缺點是離心時間較長，需制備梯度液，操作要求高。按照離心分離原理，密度梯度離心又可分為速率區(qū)帶離心法（rate zonal centrifugation method，R-Z）又稱連續(xù)密度梯度離心法和等密度離心法 (isopycnic centrifugation method) 又稱不連續(xù)密度梯度離心法。
速率區(qū)帶離心也可稱為等區(qū)密度離心，是根據(jù)樣品中不同組分粒子所具有的不同的體積大小和不同的沉降系數(shù)將混合樣品進行離心分離提純。離心時將需要分離的樣品溶液置于由密度梯度材料，如蔗糖、氯化銫 (CsCI)、溴化鈉等形成的梯度液柱上面，樣品粒子的密度必須大于梯度液柱中任一點的密度，否則得不到理想的區(qū)帶離心效果。
離心時，混合樣品中不同的組分將在梯度液柱的不同位置分別形成各自的區(qū)帶，選擇適合的轉(zhuǎn)速和時間進行離心，當(dāng)各組分區(qū)帶距離拉得最遠時，結(jié)束離心，然后將區(qū)帶取出。這樣只需通過一次離心就可以把混合樣品中的各組分分離提純，其純度和回收率均可滿足要求。優(yōu)點是一次分離純化，組分的沉降系數(shù)相差 20% 以上的即可選用此法，分辨力高，操作熟練可以將組分沉降系數(shù)相差 5%～10% 的樣品很好的分離。
缺點是材料的條件限制，樣品液濃度不能太高，否則操作條件很難控制，同時此法與差速離心法相比，處理樣品的量要小的多。
速率區(qū)帶離心的時間必須嚴(yán)格控制，不能太短，否則樣品區(qū)帶不清，時間也不能太長，否則待分離組分可能沉底。需要分離的樣品顆粒的沉降速度取決丁顆粒形狀、大小、密度及離心力等因素。離心前后樣品的狀態(tài)如圖 2 所示。
速率區(qū)帶離心最經(jīng)典的應(yīng)用就是通過蔗糖密度梯度離心，進行各種亞細(xì)胞器（核糖體、線粒體、Exosome 等）和病毒顆粒（病毒載體、疫苗等）的純化。例如，我們在上一期中得到的 70S 核糖體沉淀，經(jīng)過水解后，可利用蔗糖密度梯度離心，進一步分離純化得到 50S 和 30S 的兩個亞基。具體的實驗流程如下：
離心方法——等密度梯度離心法
等密度梯度離心也稱為平衡密度梯度離心。等密度梯度離心是根據(jù)樣品中各組分的浮力密度差不同進行分離。在離心立場中，溶液中顆粒浮力密度小則上浮，浮力密度大則下沉，上浮和下沉的顆粒會一直延梯度液移動到與其浮力密度恰好相等的位置上，該位置也稱顆粒的等密度點，離心時樣品各組分顆粒將按其密度大小分別移至等密度點形成區(qū)帶，形成的區(qū)帶不會因離心時間長而發(fā)生變化。離心后收集所需區(qū)帶顆粒即為純化組分。
因此，在離心前，樣品可置于梯度液的任意位置，一般是均勻分布在梯度液中。等密度區(qū)帶離心法的離心效果取決于樣品顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越顯著，與樣品顆粒的大小與現(xiàn)狀無關(guān)。
速率區(qū)帶離心和等密度區(qū)帶離心都需預(yù)準(zhǔn)備梯度液。速率區(qū)帶離心的梯度液密度必須小于待分離組分中最小顆粒的浮力密度。利用顆粒形狀和大小差異而形成的沉降速率不同達到分離目的。等密度區(qū)帶離心是一種平衡離心方法，利用顆粒密度差進行分離，與顆粒形狀和大小無關(guān)，處理量比差速離心法大。
等密度梯度離心經(jīng)常使用的梯度液包括氯化銫 (CsCI)、溴化鈉等，典型的應(yīng)用包括質(zhì)粒 DNA（或者其他 DNA、RNA 核酸片段）的大規(guī)模高純度純化，脂蛋白的分離純化等。
質(zhì)粒 DNA 的氯化銫等密度梯度離心分離純化流程如下：
脂蛋白溴化鈉等密度梯度離心分離純化流程如下：
1) 人全血 1000 g 離心 10 分鐘去除各種血細(xì)胞，上清為血清。
2) 血清加入 NaBr 密度梯度液（不連續(xù)梯度）的底部，往上依次鋪濃度變小的梯度液。
3) 然后在水平轉(zhuǎn)頭中，260,000 g 離心力 14℃ 下離心 24 小時，各種密度的脂蛋白從管底浮向它們自己的等密度區(qū)形成了純的各種密度脂蛋白區(qū)。而離心管底部保留著各種血清蛋白。
4) 用上排法從離心管中抽出格層液體，經(jīng) DU 核酸蛋白分析儀測定，定位各種不同密度血清脂蛋白。
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