質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法原理

堿裂解法是基于DNA的變性與復(fù)性差異而達(dá)到分離目的的。堿性使質(zhì)粒DNA變性，再將pH值調(diào)至中性使其復(fù)性，復(fù)性的為質(zhì)粒DNA，而染色體DNA不會(huì)復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀物質(zhì)，通過離心除去。

一、材料與試劑準(zhǔn)備

1.  材料：大腸桿菌。

2.  儀器：超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺(tái)式離心機(jī)，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機(jī)，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測(cè)儀。

3.  試劑：

（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl（pH7.4），10 mM EDTA（pH8.0），50 mM葡萄糖，高壓滅菌，4℃保存。

（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高壓滅菌，4℃保存。

（4）3 M NaAc pH5.2，高壓滅菌，4℃保存。

（5）異丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，無水乙醇，70%乙醇，LB培養(yǎng)基，電泳試劑。

二、操作步驟

1.  細(xì)菌繁殖：LB培養(yǎng)基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，搖一搖，過夜。

2.  離心10 min，5 000 rpm， 4℃；棄上淸液。

3.  沉淀（菌體細(xì)胞）預(yù)冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入預(yù)冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。

4.  重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min。

5.  加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。

6.  加入0.9 ml預(yù)冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12 000 rpm，4℃。

7.  加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內(nèi)放置15 min。

8.  離心10 min，12 000 rpm，4℃。

9.  取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中。

10.  加入40 ul，3 M NaAc。

11.  酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。

12.  離心10 min，12 000 rpm，4℃。

13.  取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。

14.  電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量。

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