植物組織中DNA和RNA的提取和鑒定
一、實驗目的
①學習和掌握從植物 組織中分離核酸的原理和操作方法。
②學習和掌握測定核酸含量的定糖法(苔黑酚法和二苯胺法)的原理及操作方法。
二、實驗原理
核酸是生物體內的主要化學成分，核酸在生物體內主要以核蛋白的形式存在。核酸分為脫氧核糖核酸 (DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA主要存在與在細胞核 中，RNA主要存在于細胞質中。
用冰冷的稀三氯乙酸或高氯酸溶液在低溫下抽提菜花勻漿，以除去酸溶性小分子 物質。再由有機溶劑如乙醇、乙醚等抽提，去除脂溶性的磷脂等物質。最后用濃鹽溶液(10%氯化鈉溶液)和0.5mol/L高氯酸(70℃)分別提取DNA 和RNA。
由于核酸和脫氧核糖核酸有特殊的顏色反應，經顯色后所呈現的顏色深淺在一定范圍內和樣品中所含的核糖和脫氧核糖的量成正比。因此可用定糖法來定性定量測定核酸。
① 核糖的測定：測定核糖的常用方法是苔黑酚法(3，5—二羥基甲苯，即Orcinol反應)。當含有核糖的RNA與濃鹽酸及3，5—二羥基甲苯在沸水水浴中加熱10～20min后，有綠色物產生，這是因為RNA脫嘌呤后的核糖與酸作用生成糠醛，后者再與3，5—二羥基甲苯作用生成綠色物質。
RNA+濃硫酸+ 綠色化合物
注意：DNA、蛋白質和黏多糖等物質對測定有干擾作用。
② 脫氧核糖的測定：測定脫氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脫氧核糖的DNA在酸性條件下和二苯胺在沸水浴中共熱后，產生藍色。這是因為DNA嘌呤核苷酸 上的脫氧核糖遇酸生成ω-羥基-6-酮基戊醛，再與二苯胺作用產生藍色物質。
DNA+少量濃硫酸或冰乙酸+ 藍色物質
注意：DNA、蛋白質和黏多糖等物質對測定有干擾作用。
此法易受多種糖類及其衍生物和蛋白質的干擾
上述兩種定糖的方法準確性較差，但快速簡便，能鑒別DNA和RNA，是鑒定核酸、核苷酸的常用方法。
三、實驗器材
① 恒溫水浴
② 電爐
③ 布氏漏斗裝置
④ 移液管
⑤ 燒杯
⑥ 量筒
⑦ 剪刀
⑧ 研體
四、材料和試劑
① 新鮮菜花
② 95%乙醇
③ 丙酮
④ 5%高氯酸溶液
⑤ 0.5mol/L三氯酸溶液
⑥ 10%氯化鈉溶液
⑦ 標準RNA溶液(5mg/100mL)
⑧ 標準DNA(15mg/100ml)
⑨ 粗氯化鈉
⑩ 海沙
? 二苯胺試劑：將1g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，再加入2.75mL濃硫酸(置冰箱中可保存6個月。使用后，在室溫下搖勻)。
? 三氯化鐵濃鹽酸溶液：將2ml10%三氯化鐵溶液(用FeCl3·6H20配制加入到)400mL濃鹽酸中。
五、操作方法
1. 核酸的分離
①取菜花的花冠20g，剪碎后置于研缽中。加入20mL 95%乙醇和少量誨砂，研磨成勻漿。然后用布氏漏斗抽濾，棄去濾液。
②向濾渣中加入20mL丙酮，攪拌均勻,抽濾，棄去濾液。
③再向濾渣中加人20mL丙酮，攪拌5min后抽濾(用力壓濾渣，盡量除去丙酮)。
④在冰鹽浴中，將濾渣懸浮在預冷的20mL 5%高氯酸溶液中攪拌抽濾棄去濾液。
⑤特濾渣懸浮于20mL 95%乙醇中，抽濾，棄去濾液。
⑧濾渣中加入20mL丙酮，攪拌5min。抽濾至干.用力壓濾渣盡量除去丙酮。
⑦將干燥的濾渣重新懸浮在40ml10%氯化鈉溶液中，在沸水浴中加熱15mln，放置、冷卻，抽濾至干，留濾液，并將此操作重復進行一次。將兩次濾液合并，為提取物一。
⑧將濾渣重新懸浮在20mL 0.5mol兒高氯酸溶液中。加熱到70℃。保溫20 min(恒溫水浴)后抽濾。留濾液為提取物二。
2.DNA和RNA的定性鑒定
①二苯胺反應：按表1加入各種試劑，反應后觀察現象井記錄結果。
表1 二苯胺反應加入試劑
| 管號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 蒸餾水/ml | 1 | - | - | - | - |
| DNA溶液/ml | - | 1 | - | - | - |
| RNA溶液/ml | - | - | 1 | - | - |
| 提取物一/ml | - | - | - | 1 | - |
| 提取物二/ml | - | - | - | - | 1 |
| 二苯胺試劑/ml | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 放沸水浴中10min后的現象 |
②苔黑酚反應：按表2加入各種試劑，反應后觀察現象井記錄結果。
表2 苔黑酚反應加入試劑
| 管號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 蒸餾水/ml | 1 | - | - | - | - |
| DNA溶液/ml | - | 1 | - | - | - |
| RNA溶液/ml | - | - | 1 | - | - |
| 提取物一/ml | - | - | - | 1 | - |
| 提取物二/ml | - | - | - | - | 1 |
| 三氯化鐵濃鹽酸溶液/ml | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 苔黑酚乙醇溶液/ml | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 放沸水浴中10-20min后的現象 |
根據現象分析提取物一和提取物二中主要含有什么物質?
六、思考題
1.核酸分離時為什么要除去小分子物質和脂類物質?本實驗是怎樣除掉的?
2.運用本實驗方法是否可以提取到能夠進行其他生物實驗用的核酸材料?
3.快速鑒別RNA和DNA的方法是什么?
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