DNA測序原理和方法

DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)降解法。

自動化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流。

美國PE ABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測序儀，其中310型是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號。

本實驗介紹的是ABI PRISM 310型DNA測序儀的測序原理和操作規(guī)程。

【原理】

ABI PRISM 310型基因分析儀(即DNA測序儀)，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司專利的四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP(標(biāo)記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。

由于分子大小不同，在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同，當(dāng)其通過毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機(jī)檢測器就可對熒光分子逐個進(jìn)行檢測，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機(jī)上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>DNA序列，從而達(dá)到DNA測序的目的。

分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。

它是一臺能自動灌膠、自動進(jìn)樣、自動數(shù)據(jù)收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。

PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。

這些凝膠顆?？讖骄?，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。

它主要由毛細(xì)管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機(jī)和電泳等附件組成。

電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟件。

它使用最新的CCD攝影機(jī)檢測器，使DNA測序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。

由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進(jìn)行DNA測序、雜合子分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進(jìn)行常規(guī)DNA測序外，還可進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫(yī)學(xué)上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。

【試劑與器材】

1．BigDye測序反應(yīng)試劑盒 主要試劑是BigDye Mix，內(nèi)含PE專利四色熒光標(biāo)記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應(yīng)緩沖液等。

2．pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對照模板 0.2g/L，試劑盒配套試劑。

3．M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，試劑盒配套試劑。

4．DNA測序模板 可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時取量1μl為宜。本實驗測定的質(zhì)粒DNA，濃度為0.2g/L，即200ng/μl。

5．引物 需根據(jù)所要測定的DNA片段設(shè)計正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。

6．滅菌去離子水或三蒸水。

7．0.2ml或和0.5ml的PCR管 蓋體分離，PE公司產(chǎn)品。

8．3mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8g NaAc?3H2O溶于70ml蒸餾水中，冰醋酸調(diào)pH至5.2，定容至100ml，高壓滅菌后分裝。

9．70%乙醇和無水乙醇。

10．NaAc/乙醇混合液 取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。

11．POP 6測序膠 ABI產(chǎn)品。

12．模板抑制試劑(TSR) ABI產(chǎn)品。

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