Sanger雙脫氧法測(cè)序原理

DNA的復(fù)制需要：DNA聚合酶，單鏈DNA模板，帶有3'-OH末端的單鏈寡核苷酸引物，4種dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。

聚合酶用模板作指導(dǎo)，不斷地將dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互補(bǔ)DNA鏈。

如果加入一種特殊核苷酸，雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），因它在脫氧核糖的3’位置缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵。

如，存在ddCTP、dCTP和三種其他的dNTP（其中一種為α-32P標(biāo)記）的情況下，將引物、模板和DNA聚合酶一起保溫，即可形成一種全部具有相同的5'-引物端和以ddC殘基為3’端結(jié)尾的一系列長(zhǎng)短不一片段的混合物。

經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制得的放射性自顯影區(qū)帶圖譜將為新合成的不同長(zhǎng)度的DNA鏈中C的分布提供準(zhǔn)確信息，從而將全部C的位置確定下來(lái)。

類(lèi)似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的條件下，可同時(shí)制得分別以ddA、ddG和ddT殘基為3‘端結(jié)尾的三組長(zhǎng)短不一的片段。

將制得的四組混合物平行地點(diǎn)加在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳板上進(jìn)行電泳，每組制品中的各個(gè)組分將按其鏈長(zhǎng)的不同得到分離，制得相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列。

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