凝膠層析的概念及其原理
凝膠層析定義
凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等。
它的突出優點是層析所用的凝膠屬于惰性載體 ，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，并且對分離成分理化性質的保持有獨到之處。
對于高分子物質有很好的分離效果。
凝膠層析是按照蛋白質分子量大小進行分離的技術，又稱之凝膠過濾，分子篩層析或排阻層析。
凝膠層析原理
單個凝膠珠本身象個"篩子"。
不同類型凝膠的篩孔的大小不同。
如果將這樣的凝膠裝入一個足夠長的柱子中，作成一個凝膠柱。
當含有大小不同的蛋白質樣品加到凝膠柱上時，比凝膠珠平均孔徑小的蛋白質就要連續不斷地穿入珠子的內部，這樣的小分子 不但其運動路程長，而且受到來自凝膠珠內部的阻力也很大，所以越小的蛋白質，把它們從柱子上洗脫下來所花費的時間越長!凝膠中只有很少的孔徑可接受大的蛋白。
因此，大的蛋白質直接通過凝膠珠之間的縫隙首先被洗脫下來。凝膠過濾所用的凝膠孔徑大小的選擇主要取決于要純化的蛋白質分子量。
凝膠層析分類
葡聚糖凝膠是指由天然高分子 -葡聚糖與其它交聯劑交聯而成的凝膠。
葡聚糖凝膠主要由Pharmacia Biotech 生產。
常見的有兩大類，商品名分別為Sephadex 和Sephacryl。
葡聚糖凝膠中最常見的是Sephadex 系列，它是葡聚糖與3-氯-1，2環氧丙烷(交聯劑)相互交聯而成，交聯度由2環氧丙烷的百分比控制。Sephadex 的主要型號是G-10 ~ G-200，后面的數字是凝膠的吸水率(單位是mL / g 干膠)乘以10。
如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干膠。
Sephadex 的親水性很好，在水中極易膨脹，不同型號的Sephadex 的吸水率不同，它們的孔穴大小和分離范圍也不同。
數字越大的，排阻極限越大，分離范圍也越大。
Sephadex 中排阻極限最大的G-200為8×10。
Sephadex 在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液以及有機溶液中都是比較穩定的，可以多次重復使用。
Sephadex 穩定工作的pH 一般為為2~10。
強酸溶液和氧化劑會使交聯的糖苷鍵水解斷裂，所以要避免Sephadex 與強酸和氧化劑接觸。
Sephadex 在高溫下穩定，可以煮沸消毒，在100 °C 下40 min 對凝膠的結構和性能都沒有明顯的影響。
Sephadex 由于含有羥基基團，故呈弱酸性，這使得它有可能與分離物中的一些帶電基團(尤其是堿性蛋白)發生吸附作用。
但一般在離子強度大于0.05的條件下，幾乎沒有吸附作用。
所以在用Sephadex 進行凝膠層析實驗時常使用一定濃度的鹽溶液作為洗脫液，這樣就可以避免Sephadex 與蛋白發生吸附，但應注意如果鹽濃度過高，會引起凝膠柱床體積發生較大的變化。
Sephadex 有各種顆粒大小(一般有粗、中、細、超細)可以選擇，一般粗顆粒流速快，但分辨率較差;細顆粒流速慢，但分辨率高。
要根據分離要求來選擇顆粒大小。
Sephadex 的機械穩定性相對較差，它不耐壓，分辨率高的細顆粒要求流速較慢，所以不能實現快速而高效的分離。
另外，Sephadex G-25和G-50中分別加入羥丙基基團反應，形成LH 型烷基化葡聚糖凝膠，主要型號為Sephadex LH-20和LH-60，適用于以有機溶劑為流動相，分離脂溶性物質，例如膽固醇、脂肪酸激素等。
Sephacryl 是葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺(N，N'-methylenebisacrylamide)交聯而成。
是一種比較新型的葡聚糖凝膠。
Sephacryl 的優點就是它的分離范圍很大，排阻極限甚至可以達到108，遠遠大于Sephadex 的范圍。
所以它不僅可以用于分離一般蛋白，也可以用于分離蛋白多糖、質粒 、甚至較大的病毒顆粒。
Sephacryl 與Sephadex 相比另一個優點就是它的化學和機械穩定性更高：Sephacryl 在各種溶劑中很少發生溶解或降解，可以用各種去污劑、胍、脲等作為洗脫液，耐高溫，Sephacryl 穩定工作的pH 一般為3~11。
另外Sephacryl 的機械性能較好，可以以較高的流速洗脫，比較耐壓，分辨率也較高，所以Sephacryl 相比Sephadex 可以實現相對比較快速而且較高分辨率的分離。
凝膠的選擇
凝膠
根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。
如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子 物質分開，由于它們在分配系數上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用Sephadex G-25和G-50，對于小肽和低分子量的物質(1000-5000)的脫鹽可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。
如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離，這種分離又叫分級分離。
一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質的凝膠，層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部，由于Kd不同，最后得到分離。
根據經驗，組別分離時，大多采用2-30cm長的層析柱，分級分離時，一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內，小于1cm產生管壁效應，大于5cm則稀釋現象嚴重。
長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對移動慢的物質宜在30-40之間。
凝膠柱的制備
凝膠型號選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去。
自然溶脹費時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。
加熱法既可節省時間又可消毒。
凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內充滿洗脫液，將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛于柱頂的容器中，然后在微微地攪拌下使凝膠下沉于柱內，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。
稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應低于層析時所需的流速。
在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。
平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無“紋路”或氣泡，或加一些有色物質來觀察色帶的移動，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。
加樣和洗脫
凝膠床經過平衡后，在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。
一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5%-10%。樣品濃度與分配系數無關，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運動受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2。
樣品加入后打開流出口，使樣品滲入凝膠床內，當樣品液面恰與凝膠床表面相平時，再加入數毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預先設計好流速，然后分部收集洗脫液，并對每一餾份做定性、定量測定。
凝膠柱的重復使用、凝膠回收與保存
一次裝柱后可以反復使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。
為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02%的疊氮鈉，在下次層析前應將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。
如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70%、90%、95%乙醇脫水平衡至乙醇濃度達90%以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。
濕態保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。
凝膠層析的應用
⑴ 脫鹽：高分子(如蛋白質、核酸、多糖等)溶液中的低分子量雜質，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。
本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質和酶類等在脫鹽過程中不易變性。
適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。
柱長與直徑之比為5-15，樣品體積可達柱床體積的25%-30%，為了防止蛋白質脫鹽后溶解度降低會形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發性鹽類。
⑵ 用于分離提純：凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質的分離提純。
凝膠對熱原有較強的吸附力，可用來去除無離子水中的致熱原制備注射用水。
⑶ 測定高分子物質的分子量：用一系列已知分子量的標準品放入同一凝膠柱內，在同一條件下層析，記錄每一分鐘成分的洗脫體積，并以洗脫體積對分子量的對數作圖，在一定分子量范圍內可得一直線，即分子量的標準曲線。
測定未知物質的分子量時，可將此樣品加在測定了標準曲線的凝膠柱內洗脫后，根據物質的洗脫體積，在標準曲線上查出它的分子量。
⑷ 高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時水分和低分子量的物質就會進入凝膠粒子內部的孔隙中，而高分子物質則排阻在凝膠顆粒之外，再經離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液
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