茚三酮顯色法測定氨基酸含量
一、目的
學(xué)習(xí)茚三酮顯色法測定氨基酸含量的方法
二、原理
茚三酮溶液與氨基酸共熱，生成氨。
氨與茚三酮和還原性茚三酮反應(yīng)，生成紫色化合物。
該化合物顏色的深淺與氨基酸的含量成正比，可通過測定570nm 處的光密度，測定氨基酸的含量。
三、 試劑 與材料
（1）標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L 溶液。
（2）pH5.4，2mol/L 醋酸緩沖液：量取86mL 2mol/L 醋酸鈉溶液，加入14mL 2mol/L乙酸混合而成。用pH 檢查校正。
（3）茚三酮顯色液：稱取85mg 茚三酮和15mg 還原茚三酮，用10mL 乙二醇甲醚溶解。
茚三酮若變?yōu)槲⒓t色，則需按下法重結(jié)晶：稱取5g 茚三酮溶于15～25mL 熱蒸餾水中，加入0.25g 活性炭，輕輕攪拌。
加熱30min 后趁熱過濾，濾液放入冰箱過夜。
次日析出黃白色結(jié)晶，抽濾，用1mL 冷水洗滌結(jié)晶，置干燥器干燥后，裝入棕色玻璃瓶保存。
還原型茚三酮按下法制備：稱取5g 茚三酮，用125mL 沸蒸餾水溶解，得黃色溶液。
將5g 維生素C 用250mL 溫蒸餾水溶解，一邊攪拌一邊將維生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不斷出現(xiàn)沉淀。
滴定后繼續(xù)攪拌15min，然后在冰箱內(nèi)冷卻到4℃，過濾、沉淀用冷水洗滌3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，備用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去過氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亞鐵，振蕩1～2h，過濾除去硫酸亞鐵，再經(jīng)蒸餾，收集沸點(diǎn)為121～125℃的餾分，為無色透明的乙二醇甲醚。
（4）60％乙醇。
（5）樣品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。
（6）分光光度計(jì)。
（7）水浴鍋。
四、操作步驟
1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
分別取0.3mmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于 試管 中，用水補(bǔ)足至1mL。
各加入1mL pH5.4，2mol/L 醋酸緩沖液；再加入1mL 茚三酮顯色液，充分混勻后，蓋住 試管 口，在100℃ 水浴 中加熱15min，用自來水冷卻。
放置5min 后，加入3mL60％乙醇稀釋，充分搖勻，用分光光度計(jì)測定OD 570 nm。
（脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)呈黃色，應(yīng)測定OD 440 nm）。
以O(shè)D 570 nm 為縱坐標(biāo)，氨基酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2．氨基酸樣品的測定
取樣品液1mL，加入pH5.4，2mol/L 醋酸緩沖液1mL 和茚三酮顯色液1mL，混勻后于100℃沸 水浴 中加熱15min，自來水冷卻。
放置5min 后，加3mL 60％乙醇稀釋，搖勻后測定OD 570 nm（生成的顏色在60min 內(nèi)穩(wěn)定）。
將樣品測定的OD 570 nm 與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，可確定樣品中 氨基酸 含量。
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