抑制劑對(duì)酶活力的影響——抑制類型的判斷和抑制劑常數(shù)（Ki）的測(cè)定

原理

抑制劑影響酶促反應(yīng)的因素之一，根據(jù)抑制劑與酶結(jié)合的特點(diǎn)可分為不可逆抑制和可逆抑制二種類型，其中可逆抑制有可分為三種類型：競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型：

酶不能同時(shí)與底物和抑制劑結(jié)合。動(dòng)力學(xué)特征為：表觀米氏常數(shù)Km"增加，Vm"不變。（下式中Ki為抑制劑常數(shù)，[I]為抑制劑濃度）。

(2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型：

抑制劑、底物能同時(shí)與酶結(jié)合，但此復(fù)合物不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物，Km"不變，Vm"下降。

（3）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型：

抑制劑必須在酶和底物結(jié)合后方能與酶形成復(fù)合物，但此物不能分解為產(chǎn)物。Km"、Vm" 都發(fā)生變化。

對(duì)于有抑制劑存在的酶促反應(yīng)，也可采用1/v～1/[S]作圖法，求出Km"、Ki、 Vm"，并利用各種可逆抑制類型的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)判斷抑制類型。

方法和步驟

取19支試管 0～18編號(hào)，0號(hào)管為空白。

各管按下表加入不同體積5mmol/L磷酸苯二鈉溶液（pH5.6），搖勻。

再加入l0mmol/L磷酸二氫鉀0.1mL或3mmol/L氟化鈉溶液0.1mL并補(bǔ)充0.2mol/L pH.5.6乙酸鹽緩沖液至各管溶液總體積為0.6mL，搖勻，于35℃恒溫水浴預(yù)熱2min。

各管計(jì)時(shí)加入稀釋好的酶液0.4mL，充分搖勻，35℃精確反應(yīng)15min后，加入1mol/L碳酸鈉溶液2mL，再加入0.5mL Folin-酚稀溶液，繼續(xù)保溫顯色10min。

0號(hào)管內(nèi)的0.4mL酶液最后加入，其它操作與無抑制劑組的第6管相同。冷卻后以0號(hào)管作空白，置分光光度計(jì) 中在680nm波長處讀取各管的吸光度A680。

結(jié)果處理

1、計(jì)算各管[S]、1/[S]值；

2、根據(jù)各管的吸光度A680值得出相當(dāng)?shù)姆雍?μmol（參見實(shí)驗(yàn)三十一），計(jì)算v、1/v值；

3、分別作KH2PO4和NaF抑制劑的1/v～1/[S]曲線（有抑制劑和無抑制劑兩條曲線作在同一坐標(biāo)軸中），判斷KH2PO4和NaF抑制劑的抑制類型；

4、計(jì)算[I]，并求出相應(yīng)的抑制劑常數(shù)Ki。

組別	無抑制劑						1mmol/L KH 2 PO 4						0.3mmol/LNaF
管號(hào)	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	0
5 mmol/L磷酸苯二鈉/mL	0.10	0.15	0.20	0.25	0.30	0.50	0.10	0.15	0.20	0.25	0.30	0.50	0.10	0.15	0.20	0.25	0.30	0.50	0.50
10mmol/L KH 2 PO 4 /mL							各管0.1
3mmol/L NaF/mL													各管0.1
0.2mmol/L乙酸鹽緩沖液 /mL	0.50	0.45	0.40	0.35	0.30	0.10	0.40	0.35	0.30	0.25	0.20	0	0.40	0.35	0.30	0.25	0.20	0	0.10
稀釋酶液/mL	各管0.4																		0.4 （最后加入）
	35℃精確反應(yīng)15min
	各管內(nèi)分別先后加1mol/L碳酸鈉溶液2mL和Folin-酚稀溶液0.5mL，35℃保溫顯色10min
A 680
磷酸苯二鈉/mmol ×L -1	0.50	0.75	1.0	1.25	1.50	2.50	0.50	0.75	1.0	1.25	1.50	2.50	0.50	0.75	1.0	1.25	1.50	2.50