轉(zhuǎn)氨酶GPT、GOT活性的測定
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1.了解轉(zhuǎn)氨酶在生物體中的生理功能。
2.掌握轉(zhuǎn)氨酶活性測定的原理和方法。
二、實(shí)驗(yàn)原理
轉(zhuǎn)氨酶是生物體內(nèi)一類非常重要的酶，其能催化α–氨基酸的α–氨基與α–酮酸的α–酮基之間的相互轉(zhuǎn)化，使生成新的氨基酸與新的酮酸。這一過程稱為轉(zhuǎn)氨基作用。轉(zhuǎn)氨作用在生物體蛋白質(zhì)的合成與分解中間代謝過程中，在糖、脂及蛋白質(zhì)三大物質(zhì)代謝的相互聯(lián)系、相互制約及相互轉(zhuǎn)變過程中至關(guān)重要。
在動(dòng)物機(jī)體中活力最強(qiáng)、分布最廣的轉(zhuǎn)氨酶有兩種：一種為谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(簡稱GOT)，另一種為谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)。它們的催化反應(yīng)如下：
此反應(yīng)最終產(chǎn)物是丙酮酸，丙酮酸可與2，4—二硝基苯肼反應(yīng)，形成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色。再與同樣處理的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比色，計(jì)算出丙酮酸含量，以此測定轉(zhuǎn)氨酶的活力。
丙酮酸 + 2，4—二硝基苯肼→丙酮酸二硝基苯腙(棕紅色)+ 水
轉(zhuǎn)氨酶的活性單位可表示為：每毫升血清與基質(zhì)在37℃下作用60分鐘，生成1μmol 丙酮酸為1個(gè)單位。
三、儀器、原料和試劑
儀器
分光光度計(jì) 、水浴鍋、試管及試管架、移液管等。
原料
血清
試劑
1. 0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH7.4)：稱取磷酸氫二鉀13.97g 和磷酸二氫鉀2.69g，溶于蒸餾水，定容至1000 mL。
2. GPT 基質(zhì)液：稱取a-酮戊二酸29.2 mg 及DL-丙氨酸1.78g，溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖液20mL中，溶解后再加緩沖液70mL，并移入100mL 容量瓶內(nèi)。加1mol/L 的NaOH 溶液0.5mL，校正pH 至7.4。
再以pH7.4的磷酸緩沖液 定容至100mL。貯存于冰箱備用，可用1周。
3. GOT 基質(zhì)液：稱取a-酮戊二酸29.2 mg 及DL-天冬氨酸2.66g，溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖液30mL中，溶解后再加緩沖液60mL，并移入100mL 容量瓶內(nèi)。加1mol/L 的NaOH 溶液0.5mL，校正pH 至7.4。再以pH7.4的磷酸緩沖液定容至100mL。貯存于冰箱備用，可用1周。
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