紫外分光光度法測定蛋白質濃度
[目的]:
掌握紫外分光光度法測定蛋白質含量的原理，熟悉紫外分光光度計的使用
[原理] :
蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它們具有吸收紫外光的性質，其吸收高峰在280nm波長處，且在此波長內吸收峰的光密度值與其濃度成正比關系，故可作為蛋白質定量測定的依據，但由于各種蛋白質的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要準確定量，必需要有待測蛋白質的純品作為標準來比較，或且已經知道其消光系數作為參考。另外，不少雜質在280nm波長下也有—定吸收能力，可能發生干擾。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶堿)的影響更為嚴重。然而核酸的最大吸收峰是在260nm。因此溶液中同時存在核酸時，必須同時測定OD 260 nm，與OD 280 nm。，然后根據兩種波長的吸收度的比值，通過經驗公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質的真實含量。
本法操作簡便迅速，且不消耗樣品(可以回收)，多用于純化之蛋白質的微量測定。主要缺點：當待測的蛋白質與標準蛋白質中的酪氨酸和色氨酸含量差異較大時，則產生—定誤差，混有核酸時必須分別測定280nm和260nm兩處的OD值，再按公式推算蛋白質含量。
[操作]
取試管7支，按下表操作：
各管混勻，盛于石英杯中，用紫外分光光度計，以空白管調節零點，分別于280nm、260nm波長下測定各管光密度
[計算]
(一) 直接根據標準液與待測液的光密度值(OD280nm)，或從標準曲線，求得樣本蛋白質含量。
以標準管各管光密度值為縱坐標，以蛋白質濃度為橫坐標繪制標準曲線，然后根據測定管光密度值，直接查標準曲線求得樣本中蛋白質的含量。
1． 選一種與待測樣本蛋白質氨基酸組成相近似的蛋白質純品，用生理鹽水稀釋至濃度為 lmg／m1，作為稀釋標準蛋白質溶液。
2．用生理鹽水稀釋待測樣本蛋白質至濃度約為lmg／m1，即為稀釋樣本蛋白質溶液。
(二)利用經驗公式直接計算樣本蛋白質含量，
準確吸取血清樣本0.1ml，置于50ml容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度，即500倍稀釋，在280nm和260nm兩處波長分別測得光密度值、再按下列公式計算。
1、OD 280 ／0D 260 ＜1.5時，用Lowry-Kalokar公式：
樣本蛋白質含量(mg／m1)＝1.45OD 280 一0.74OD2 60
2、OD 280 ／OD 260 ﹥1.5時，用Lamber-Beer定律計算：
樣本蛋白質含量(mg／m1) = OD 280 ／K×L＝（OD 280 ／6.3×1）×10g／L
本實驗樣品：牛血清白蛋白E 1% cm＝6.3（100ml／cm.g）
K：克分子消光系數；E 1% cm：百分比吸光度的吸光系數；
注：不同蛋白質中的酪氨酸和色氨酸含量有差異，故標準管與測定管的蛋白質氨基酸組成應相似，以減小誤差。
[器材]
(一)UV-9200紫外分光光度計
(二)50ml容量瓶
[試劑]
(一) 生理鹽水
(二) 清蛋白(人或牛)純晶
(三) 待測樣本蛋白質：用雙縮脲法測定蛋白質的樣品用生理鹽水稀釋而成。
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