蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)、顏色反應(yīng)、兩性反應(yīng)、電荷及等電點(diǎn)的測(cè)定
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
1.熟悉蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)、顏色反應(yīng)和兩性反應(yīng)及其機(jī)理。
2.掌握蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定方法及其原理。
3.掌握蛋白質(zhì)電荷的測(cè)定方法及其機(jī)理。
二、實(shí)驗(yàn)原理
(一)蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)原理
蛋白質(zhì)的水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團(tuán)，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度親和性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與水相遇時(shí)，就很容易被蛋白質(zhì)吸住，在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水膜(又稱水化層)。水膜的存在使蛋白顆粒相互隔開(kāi)，顆粒之間不會(huì)碰撞而聚成大顆粒。因此蛋白質(zhì)在溶液中比較穩(wěn)定而不會(huì)沉淀。蛋白質(zhì)能形成較穩(wěn)定的親水膠體的另一個(gè)原因，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)顆粒在非等電狀態(tài)時(shí)帶有相同電荷，使蛋白質(zhì)顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致相互凝集沉淀。
蛋白質(zhì)由于帶有電荷和水膜，因此在水溶液中形成穩(wěn)定的膠體。當(dāng)某些物理化學(xué)因素破壞了蛋白質(zhì)的水膜或中和了蛋白質(zhì)的電荷，則蛋白質(zhì)膠體溶液就不穩(wěn)定而出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。 蛋白質(zhì)可因加入下列試劑而產(chǎn)生沉淀：
1.加鹽類如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等可以破壞蛋白質(zhì)膠體周圍的水膜，同時(shí)又中和了蛋白質(zhì)分子 的電荷，因此使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀，這種加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象稱鹽析。鹽析法是分離制備蛋白質(zhì)的常用方法，不同蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需的鹽濃度不同，因此調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出，這種方法叫做分段鹽析。但中性鹽并不破壞蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，因此，若除去或降低鹽的濃度，蛋白質(zhì)就會(huì)重新溶解。
2.加有機(jī)溶劑如酒精、丙酮等可使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀，這是由于這些有機(jī)溶劑和水有較強(qiáng)的作用，破壞了蛋白質(zhì)分子周圍的水膜，因此發(fā)生沉淀作用。若及時(shí)將蛋白質(zhì)沉淀與丙酮或乙醇分離，蛋白質(zhì)沉淀則可重新溶解于水中。
3.重金屬鹽如氯化汞、硝酸銀、醋酸鉛及三氯化鐵等。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在堿性溶液中帶負(fù)離子，可與這些重金屬的正離子作用而生成不易溶解的鹽而沉淀。
4.某些酸類如苦味酸、單寧酸、三氯乙酸等能和蛋白質(zhì)化合成不溶解的蛋白質(zhì)鹽而沉淀。
用鹽析法或低溫下加入丙酮、乙醇使蛋白質(zhì)沉淀，以及利用等電點(diǎn)的沉淀反應(yīng)時(shí)，雖然蛋白質(zhì)已經(jīng)沉淀析出，然而其分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)并沒(méi)發(fā)生明顯的改變，仍保持原有的生物活性。如除去沉淀因素，蛋白質(zhì)可重新溶解在原來(lái)的溶劑中。因此，這種沉淀作用稱為可逆沉淀作用。但如在溫度較高情況下加入有機(jī)溶劑來(lái)沉淀分離蛋白質(zhì)或已用有機(jī)溶劑沉淀分離得到的蛋白質(zhì)沒(méi)有及時(shí)與有機(jī)溶劑分開(kāi)，都會(huì)引起蛋白質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生改變，這應(yīng)該注意。
(二)蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)原理
蛋白質(zhì)分子中的某些基團(tuán)與顯色劑作用，可產(chǎn)生特定的顏色反應(yīng)，不同蛋白質(zhì)所含氨基酸不完全相同，顏色反應(yīng)亦不同。顏色反應(yīng)不是蛋白質(zhì)的專一反應(yīng)，一些非蛋白物質(zhì)亦可產(chǎn)生相同顏色反應(yīng)，因此不能僅根據(jù)顏色反應(yīng)的結(jié)果決定被測(cè)物是否是蛋白質(zhì)。顏色反應(yīng)是一些常用的蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)。重要的顏色反應(yīng)有：
1.雙縮脲反應(yīng)
將尿素加熱到180℃，則兩分子尿素縮合而成一分子雙縮脲，并放出一分子氨。雙縮脲在堿性溶液中能與硫酸銅反應(yīng)產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物，此反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應(yīng)，形成紅紫色絡(luò)合物。通常可用此反應(yīng)來(lái)定性鑒定蛋白質(zhì)，也可根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)生的顏色在540nm 處比色，定量測(cè)定蛋白質(zhì)。
2.蛋白質(zhì)的黃色反應(yīng)
是含有芳香族氨基酸特別是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白質(zhì)所特有的呈色反應(yīng)。蛋白質(zhì)溶液遇硝酸后，先產(chǎn)生白色沉淀，加熱則白色沉淀變成黃色，再加堿顏色加深呈橙黃色，這是因?yàn)橄跛釋⒌鞍踪|(zhì)分子中的苯環(huán)硝化，產(chǎn)生了黃色硝基苯衍生物。例如皮膚、指甲和毛發(fā)等遇濃硝酸會(huì)變成黃色。
3.米倫氏反應(yīng)
米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合物，蛋白質(zhì)溶液加入米倫試劑后即產(chǎn)生白色沉淀，加熱后沉淀變成紅色。酚類化合物有此反應(yīng)，酪氨酸含有酚基，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白質(zhì)都有此反應(yīng)。
4.茚三酮反應(yīng)
蛋白質(zhì)與茚三酮共熱，則產(chǎn)生藍(lán)紫色的還原茚三酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應(yīng)為一切氨基酸及α-氨基酸所共有。含有氨基的其他物質(zhì)亦呈此反應(yīng)。
5.乙醛酸反應(yīng)
在蛋白質(zhì)溶液中加入乙醛酸，并沿管壁慢慢注入濃硫酸，在兩液層之間就會(huì)出現(xiàn)紫色環(huán)，凡含有吲哚基的化合物都有這一反應(yīng)。色氨酸及含有色氨酸的蛋白質(zhì)有此反應(yīng)，不含色氨酸的白明膠就無(wú)此反應(yīng)。
6.坂口反應(yīng)
精氨酸分子中含有胍基，能與次氯酸鈉(或次溴酸鈉)及α-萘酚在氫氧化鈉溶液中產(chǎn)生紅色產(chǎn)物。此反應(yīng)可以用來(lái)鑒定含有精氨酸的蛋白質(zhì)，也可用來(lái)定量測(cè)定精氨酸含量。
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