SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>
1.學(xué)習(xí)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)的原理；
2.掌握垂直板電泳的操作方法。
二、實(shí)驗(yàn)原理:
1、電泳：
(1)定義：是指帶電粒子在電場(chǎng)中向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。
(2)影響電泳效果的因素：
①帶電顆粒的大小和形狀：顆粒越大，電泳速度越慢，反之越快；
②顆粒的電荷數(shù)：電荷越少，電泳速度越慢，反之越快；
③溶液的粘度：粘度越大，電泳速度越慢，反之越快；
④溶液的pH值：影響被分離物質(zhì)的解離度，離等電點(diǎn)越近，電泳速度越慢，反之越快；
⑤電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度越小，電泳速度越慢，反之越快；
⑥離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越大，電泳速度越慢，反之越快；
⑦電滲現(xiàn)象：電場(chǎng)中，液體相對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)；
⑧支持物篩孔大小：孔徑小，電泳速度慢，反之則快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）
(1)定義
?聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳。
?SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉）
(2)SDS的作用
?SDS是一種陰離子去垢劑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。?由于SDS帶有大量負(fù)電荷，好比蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的“外衣”，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋,即消除了蛋白質(zhì)分子之間電荷差異。?因此在電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于蛋白質(zhì)分子大小
(3) SDS-PAGE分類：
?SDS-PAGE按照緩沖液pH值和凝膠孔徑差異分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類：
連續(xù)系統(tǒng)：電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。
不連續(xù)系統(tǒng)：緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度均不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳
(4)聚丙烯胺凝膠的生成：
聚丙烯胺凝膠由丙烯酰胺單體（Acr）和N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下聚合而成。在具有自由基時(shí)，Acr和Bis就會(huì)聚合。
引發(fā)產(chǎn)生自由基的方法有兩種：
①化學(xué)法
②光聚合法
①化學(xué)聚合：
引發(fā)劑是過硫酸銨(AP)，催化劑N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED），它的堿基催化AP產(chǎn)生氧自由基，激活單體形成自由基，發(fā)生聚合。化學(xué)聚合形成的凝膠孔徑較小，且重復(fù)性好，用來制備分離膠；
②光聚合：
催化劑是核黃素（VB 2 ），在痕量氧存在下，核黃素光解形成無色基，無色基再被氧氧化成自由基，激活單體發(fā)生聚合。光聚合形成的凝膠孔徑較大，且不穩(wěn)定，適于制備大孔徑的濃縮膠。
聚合反應(yīng)：
(5)聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)：
①聚丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)為丙烯酰胺單體構(gòu)成的長(zhǎng)鏈，鏈與鏈之間通過甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起；
②鏈的縱橫交錯(cuò)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使凝膠具有分子篩的性質(zhì)；
③網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能限制蛋白質(zhì)等樣品的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，使凝膠具有抗對(duì)流的作用；
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