影響限制性內切酶活性的因素
1 DNA 純度
在 DNA 樣品中若含有蛋白質，或沒有去除干凈制備過程中所用的乙醇、 EDTA 、 SDS 、酚、氯仿和某些高濃度金屬離子，均會降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。
2 核酸內切限制酶的緩沖液
核酸內切限制酶的標準緩沖液包括氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、 Tris-HCL 、巰基乙醇或二硫蘇糖醇 (DTT) 以及牛血清白蛋白 (BSA) 等。
使用所有限制酶均可發揮活性的一種緩沖液。
不同限制性內切酶對 NaCl 濃度的要求不同，這是不同限制酶緩沖液組成上的一個主要的不同。據此可分為高鹽、中鹽和低鹽緩沖液，在進行雙酶解或多酶解時，若這些酶切割可在同種緩沖液中作用良好，則幾種酶可同時酶切；若這些酶所要求的緩沖液有所不同，可采用以下三種方法進行消化反應：先用要求低鹽緩沖液的限制性內切酶消化 DNA ，然后補足適量的 NaCl ，再用要求高鹽緩沖液的限制酶消化；
先用一種酶進行酶解，然后用乙醇沉淀酶解產物，再重懸于另一緩沖液中進行第二次酶解。
3 酶切消化反應的溫度
DNA 消化反應的溫度，是影響限制內切酶活性的一個重要因素。不同的核酸內切限制酶，具有各自的最適反應溫度。多數限制內切酶的最適反應溫度是 37℃ ，少數限制性內切酶的最適反應溫度高于或低于 37℃ 。
4 DNA 的分子結構
DNA 分子構型對核酸內切限制酶的活性有很大影響，如消化超螺旋的 DNA 比消化線性 DNA 用酶量要高出許多倍。
有些限制酶在消化它們自己的處于不同部位的限制位點，其效率也有明顯差異。
限制性內切酶反應的終止 通常是采用 65℃ 條件下溫浴 5min ；
加終止反應液（如 0.5mol/L 的 EDTA 使之在溶液中的終濃度達到 10 mol/L ）螯合 Mg2 ，以終止反應。
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