蛋白質濃度測定——雙縮脲法
[原理]
將尿素加熱，兩分子尿素放出一分子氨而形成雙縮脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）。
雙縮脲在堿性溶液中與Cu2+結合生成紫色絡合物，這一呈色反應稱為雙縮脲反應。蛋白質分子中的肽鍵類似雙縮脲結構，故亦能呈雙縮脲反應。
在一定的濃度范圍內，顏色深淺與蛋白質含量呈線性關系。蛋白質濃度越高，體系的顏色越深。反應產物在540nm處有最大光吸收。
將未知濃度的樣品溶液與一系列已知濃度的標準蛋白質溶液同時與雙縮脲 試劑 反應，并于540nm比色，可通過標準濃度蛋白質繪制的標準曲線，求得未知樣品蛋白質的濃度。
凡含有一個肽鍵和一個-CSNH2、-CRHNH2、-CHNH2-CHNH2-CH2OH、-CHOH-CH2OH、-CHOH-CH2NH及乙二酰二胺等物質也有此反應。
本法操作簡便，迅速，蛋白質濃度與光密度的線性關系好，是蛋白質濃度分析的常用方法之一，但本法缺點是靈敏度較低，蛋白質量須在1～20mg/ mL方有較佳結果。在需要快速，但準確性要求不高的測定中，常用此法。
[方法與步驟]
標準曲線的繪制
取6支試管從0～5編號，按下表分別加入各 試劑 ，每加一種試液均須混勻，加畢后于室溫放置30分鐘，然后以0號管作為空白對照管，540nm處測定各管A值。
管號 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
標準酪蛋白/mL 蒸餾 水/mL 雙縮脲試劑/mL | 0 1.0 4.0 | 0.2 0.8 4.0 | 0.4 0.6 4.0 | 0.6 0.4 4.0 | 0.8 0.2 4.0 | 1.0 0 4.0 |
以標準酪蛋白（mg）為橫坐標，A 540值為縱坐標，繪制標準曲線。
未知濃度的樣液測定
可用牛奶中提取的酪蛋白配制溶液。未知酪蛋白濃度的樣品測定3管。方法步驟與上述標準曲線制作過程的5號管相同，僅用未知濃度酪蛋白溶液1.0mL代替標準酪蛋白。
標準曲線的制作與未知濃度蛋白測定過程是同時進行的。
根據未知濃度酪蛋白試液的A540值，在標準曲線上查出其對應的蛋白毫克數，即為所測酪蛋白溶液的質量濃度(mg/mL)。
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