高效液相色譜、液液色譜、液—固色譜法的固定相和流動(dòng)相
一、固定相
高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。可承受壓力上限為3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。
1. 表面多孔型固定相
它的基體是實(shí)心玻璃球，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化硅、離子交換劑、分子 篩、聚酰胺等。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對(duì)死體積小，出峰迅速、柱效亦高;顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)到平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受到限制。
2. 全多孔型固定相
由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于顆 粒很細(xì)(5～10μm)，孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。
二、流動(dòng)相
由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親合力，并參與固定相對(duì)組分的競爭，因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是：
(1)溶劑對(duì)于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。
(2)溶劑與檢測器匹配。對(duì)于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長 要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時(shí)， 溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不
透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測量。對(duì)于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)到最高靈敏度。
(3)高純度
由于高效液相色譜靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也
要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。
(4)化學(xué)穩(wěn)定性好
(5)低粘度(粘度適中)若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等;但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自?/span>色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。
液—固色譜法
液固色譜的固定相是固體吸附劑。吸附劑是一些多孔的固體顆粒物質(zhì)，位于其表面的原子、離子或分子的性質(zhì)是多少不同于在內(nèi)部的原子、離子或分子的性質(zhì)的。表層的鍵因缺乏覆蓋層結(jié)構(gòu)而受到擾動(dòng)。因此，表層一般處于較高的能級(jí)，存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。因此，液固色譜法是根據(jù)各組分在固定相上的吸附能力的差異進(jìn)行分離，故也稱為液固吸附色譜。吸附劑吸附試樣的能力，主要取決于吸附劑的比表面積和理化性質(zhì)，試樣的組成和結(jié)構(gòu)以及洗脫液的性質(zhì)等。組分與吸附劑的性質(zhì)相似時(shí)，易被吸附，呈現(xiàn)高的保留值;當(dāng)組分分子結(jié)構(gòu)與吸附劑表面活性中心的剛性幾何結(jié)構(gòu)相適應(yīng)時(shí)，易于吸附。從而使吸附色譜成為分離幾何異構(gòu)體的有效手段;不同的官能團(tuán)具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按族分離化合物。吸附色譜對(duì)同系物沒有選擇性(即對(duì)分子量的選擇性小)，不能用該法分離分子量不同的化合物。
一、液固色譜法固定相
液固色譜法采用的固體吸附劑按其性質(zhì)可分為極性和非極性兩種類型。極性吸附劑包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等。非極性吸附劑最常見的是活性炭。極性吸附劑可進(jìn)一步分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑包括硅膠和硅酸鎂等，堿性吸附劑有氧化鋁、氧化鎂和聚酰胺等。酸性吸附劑適于分離堿，如脂肪胺和芳香胺。堿性吸附劑則適于分離酸性溶質(zhì)，如酚、羧和吡咯衍生物等。各種吸附劑中，最常用的吸附劑是硅膠，其次是氧化鋁。在現(xiàn)代液相色譜中，硅膠不僅作為液固吸附色譜固定相，還可作為液液分配色譜的載體和鍵合相色譜填料的基體。
三、液-固吸附色譜流動(dòng)相
液相色譜的流動(dòng)相必須符合下列要求：
(1)能溶解樣品，但不能與樣品發(fā)生反應(yīng)。
(2)與固定相不互溶，也不發(fā)生不可逆反應(yīng)。
(3)粘度要盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效。
(4)應(yīng)與所用檢測器相匹配。例如利用紫外檢測器時(shí)，溶
劑要不吸收紫外光。
(5)容易精制、純化、毒性小，不易著火、價(jià)格盡量便宜等。在液-固色譜中，選擇流動(dòng)相的基本原則是 極性大的試樣用極性較強(qiáng)的流動(dòng)相，極性小的則用低極性流動(dòng)相。為了獲得合適的溶劑極性，常采用兩種、三種或更多種不同極性的溶劑混合起來使用，如果樣品組分的分配比k值范圍很廣則使用梯度洗脫。
液液色譜法
液液色譜又稱液液分配色譜。在液液色譜中，一個(gè)液相作為流動(dòng)相，而另一個(gè)液相則涂漬在很細(xì)惰性載體或硅膠上作為固定相。流動(dòng)相與固定相應(yīng)互不相溶，兩者之間應(yīng)有一明顯的分界面。分配色譜過程與兩種互不相溶的液體在一個(gè)分液漏斗中進(jìn)行的溶劑萃取相類似。以氣液分配色譜法一樣，這種分配平衡的總結(jié)果導(dǎo)致各組分的差速遷移，從而實(shí)現(xiàn)分離。分配系數(shù)(K)或分配比(k)小的組分，保留值小，先流出柱。然而與氣相色譜 法不同的是，流動(dòng)相的種類對(duì)分配系數(shù)有較大的影響。
一、固定相
液液色譜的固定相由載體和固定液組成。常用的載體有下列幾類：
(1)表面多孔型載體(薄殼型微珠載體)，由直徑為30 ~ 40μm的實(shí)心玻璃球和厚度約為1 ～ 2 μm的多孔性外層所組成。
(2)全多孔型載體，由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑30 ~ 50 μm的多孔型顆粒。
(3)全多孔型微粒載體，由nm級(jí)的硅膠微粒堆積而成，又稱堆積硅珠。這種載體粒度為5 ～ 10 μm。由于顆粒小， 所以柱效高，是目前使用最廣泛的一種載體。
由于液相色譜中，流動(dòng)相參與選擇作用，流動(dòng)相極性的微小變化，都會(huì)使組分的保留值出現(xiàn)較大的差異。因此，液相色譜中，只需幾種不同極性的固定液即可。如， —氧二丙腈(ODPN)，聚乙二醇(PEG)，十八烷(ODS)和角鯊?fù)楣潭ㄒ旱取?/span>
二、流動(dòng)相
在液液色譜中，除一般要求外，還要求流動(dòng)相對(duì)固定相的溶解度盡可能小，因此固定液和流動(dòng)相的性質(zhì)往往處于兩 個(gè)極端，例如當(dāng)選擇固定液是極性物質(zhì)時(shí)，所選用的流動(dòng)相通常是極性很小的溶劑或非極性溶劑。
以極性物質(zhì)作為固定相，非極性溶劑作流動(dòng)相的液液色譜，稱為正相分配色譜，適合于分離極性化合物;反之，如選用非極性物質(zhì)為固定相，而極性溶劑為流動(dòng)相的液液色譜稱為反相分配色譜，這種色譜方法適合于分離芳烴、稠環(huán)芳烴及烷烴等化合物。
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