RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟
一、組織抽提：
1. 取組織塊50-100㎎用液氮在研缽中研磨成粉末
2. 移入玻璃勻漿器加入1ml Trizol 抽打勻漿
3. 移入1.5ml新離心管用5 ml針頭抽打
4. 冰上孵育5分鐘
5. 離心12,000g 4℃ 5分鐘 取上清液移入1.5ml新離心管
6. 加0.2 ml氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘
7. 離心<12,000g 4℃ 10分鐘 取上層液相移入1.5ml新離心管
8. 加0.5 ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘
9. 離心<12,000g 4℃ 5分鐘 棄去上清液
10. 加入1 ml 75%乙醇，震蕩
11. 離心<7,500g 4℃ 5分鐘 棄去上清液
12. 室溫下使之變透明
13. 加入DEPC處理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低溫冰箱）
14. 走RNA變性電泳觀察18s，28s條帶，分光光度計(jì)檢測(cè)260/280吸光度比值，計(jì)算RNA濃度
二、RT反應(yīng)體系（第一步）：約20分鐘
RNA 抽提物
5μl
Radome 引物
2μl
RNA sin
0.5μl
1. 65℃ 15分鐘
2. 立即放入冰浴
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