分子信標(biāo)的原理、應(yīng)用及其研究進(jìn)展
摘要
分子信標(biāo)技術(shù)是一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象（FRET）和堿基互補(bǔ)配對(duì)原則建立起來(lái)的一種分析技術(shù)。
分子信標(biāo)作為一種熒光標(biāo)記的分子探針，具有極強(qiáng)的特異性和較高的靈敏度，目前已經(jīng)成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的重要研究工具。
本文著重介紹了分子信標(biāo)的基本原理及其應(yīng)用，并對(duì)其近年來(lái)的研究進(jìn)展做以簡(jiǎn)單介紹。
1 引言
在基因時(shí)代和蛋白質(zhì)時(shí)代，人們迫切需要一種具有高靈敏度和高親和力的生物分子探針，用以進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。1996年Tyagi和Kramer首先建立了分子信標(biāo)技術(shù)，很快這種技術(shù)就廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和化學(xué)等諸多領(lǐng)域。
分子信標(biāo)技術(shù)具有極高的特異性，而且操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，特別是它可以進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)、甚至可以用于活體分析。
在臨床診斷、基因檢測(cè)等領(lǐng)域，分子信標(biāo)也越來(lái)越顯示出它的優(yōu)勢(shì)。
近年來(lái)，人們對(duì)分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)作了諸多改進(jìn)，發(fā)展出很多具有更多特性的新型分子信標(biāo)。
隨著分子信標(biāo)的發(fā)展，該技術(shù)也必將在更多領(lǐng)域中發(fā)揮出它的優(yōu)勢(shì)。
2 分子信標(biāo)的原理
分子信標(biāo)是一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈，一般含有25～35個(gè)核苷酸。在結(jié)構(gòu)上，分子信標(biāo)大體上可以分為三部分：
（1）、環(huán)狀區(qū)：一般由15～30個(gè)核苷酸組成，可以與靶分子特異結(jié)合；
（2）、莖干區(qū)：一般由5～8個(gè)堿基對(duì)組成，在分子信標(biāo)與靶分子結(jié)合過(guò)程中可發(fā)生可逆性解離。
（3）、熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)：熒光基團(tuán)一般連接在5ˊ端；淬滅基團(tuán)一般連接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作為淬滅基團(tuán)。
根據(jù)Foerster理論，中心熒光能量轉(zhuǎn)移效率與兩者距離的6次方成反比。所以只有熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間達(dá)到一定的距離時(shí)才會(huì)產(chǎn)生熒光。
自由狀態(tài)時(shí)，分子信標(biāo)呈發(fā)卡式結(jié)構(gòu)，從而熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相距較近（約7～10nm）。
此時(shí)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被淬滅，熒光本底極低。
當(dāng)分子信標(biāo)與靶分子結(jié)合時(shí)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間的距離加大，從而，分子信標(biāo)的熒光幾乎100%恢復(fù)。
而且所檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度與溶液中靶標(biāo)量成正比。
3 影響分子信標(biāo)的主要因素
分子信標(biāo)中，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間的距離是影響分子信標(biāo)的最主要因素。
根據(jù)Foerster理論，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間的距離直接影響熒光的強(qiáng)度。
另外，溫度也是影響分子信標(biāo)的一個(gè)重要因素。
在較低溫度下，分子信標(biāo)才可以保持發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
在較高溫度下，分子信標(biāo)將無(wú)法保持其發(fā)卡結(jié)構(gòu)，甚至使其伸展為隨機(jī)線狀，造成熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而發(fā)出熒光，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。有文獻(xiàn)表明，其熔鏈溫度取決于莖干區(qū)的長(zhǎng)度、G-C含量和緩沖液的離子強(qiáng)度。
Bonnet等研究溫度對(duì)分子信標(biāo)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，體系的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)為一個(gè)先減弱后增強(qiáng)的過(guò)程。就此，Bonnet等做出如下解釋：
在較低溫度下，分子信標(biāo)與靶標(biāo)結(jié)合呈S1狀態(tài)，發(fā)出熒光。隨著溫度升高，分子信標(biāo)與靶標(biāo)分離，分子信標(biāo)重新恢復(fù)為發(fā)卡式結(jié)構(gòu)即S2狀態(tài)，從而熒光強(qiáng)度減弱。溫度持續(xù)增高，將導(dǎo)致分子信標(biāo)熔鏈即S3狀態(tài)，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，導(dǎo)致熒光恢復(fù)。
環(huán)境pH值也是影響分子信標(biāo)的一個(gè)因素。pH值過(guò)高，分子信標(biāo)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可能被破壞，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。此外，分子信標(biāo)的純度，也將對(duì)分子信標(biāo)產(chǎn)生影響。
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