核酸含量的測定——紫外吸收法
[原理]
核苷、核苷酸、核酸的組成成分中都有嘌呤、嘧啶堿基，這些堿基都具有共軛雙鍵 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光區(qū)的250-280nm處有強(qiáng)烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm左右。常利用核酸的紫外吸收性進(jìn)行核酸的定量測定。
核酸的摩爾消光系數(shù)ε(P)表示為每升溶液中含有1摩爾原子磷的光吸收值。RNA的ε(P)260nm（pH7.0）為7 700～7 800，RNA的含磷量約9.5%，因此每毫升溶液含1μg RNA的光吸收值相當(dāng)于0.022～0.024。小牛胸腺DNA鈉鹽的ε(P) 260nm（pH7.0）為6 600，含磷量為9.2%，因此每毫升溶液含1μg DNA鈉鹽的光吸收值相當(dāng)于0.020。
測出260nm處的光吸收值，可計(jì)算出核酸的含量。當(dāng)核酸變性降解時，其紫外吸收強(qiáng)度顯著增加，稱為增色效應(yīng)。
蛋白質(zhì)也有紫外吸收，通常蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm波長處，在260nm處的吸收值僅為核酸的1/10或更低，因此對于含有微量蛋白質(zhì)的核酸樣品，測定誤差較小。若待測的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的雜質(zhì)，則測定誤差較大，應(yīng)設(shè)法除去。不純的樣品不能用紫外吸收值作定量測定。
從A 260 / A 280 的比值可判斷樣品的純度。純RNA的A 260 / A 280 ≥2.0；DNA的A 260 / A 280 ≥1.8。當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時，則比值下降。RNA和DNA的比值分別低于2.0和1.8時，表示此樣品不純。
pH對核酸紫外吸收性有影響，所以在測定時要固定溶液的pH值。
本實(shí)驗(yàn)采用常用的比消光系數(shù)法來測定核酸含量。
[方法和步驟]
1、測定
取潔凈 離心管 甲乙兩支，分別準(zhǔn)確加入1.0mL DNA/RNA樣液，然后向甲管加入1.0mL 蒸餾 水，向乙管加入1.0ml過氯酸-鉬酸銨沉淀劑，搖勻后置冰箱內(nèi)30min，使沉淀完全。3000r/min離心10min，各吸取上清液0.5mL轉(zhuǎn)入相應(yīng)的甲乙兩容量瓶內(nèi)，定容至50mL。以 蒸餾 水作空白對照，使用紫外光度計(jì)分別測定上述甲乙兩稀釋A 260 值。
2、計(jì)算
試液中DNA / RNA總含量按下式計(jì)算：
式中 甲A 260 ——被測稀釋液在260nm處的總光密度值；
乙A 260 ——加沉淀劑除去大分子核酸后被測稀釋液在260nm處的光密度值；
兩者之差（甲A 260 －乙A 260 ）為被測稀釋液的光密度值；
V B ——被測試液總體積（mL）
D——樣液的稀釋倍數(shù)。
0.020——脫氧核糖核酸的比消光系數(shù)，即每毫升含1μgDNA鈉鹽的水溶液（pH為中性）在260nm波長處，通過光徑為1cm時的光密度值。
0.022——核糖核酸的比消光系數(shù)，是濃度為1mg/L的核糖核酸水溶液（pH為中性）在260nm波長處，通過光徑為1cm時的光密度值。
由于大分子核酸易發(fā)生變性，此值也隨變性程度不同而異，因此一般采用比消光系數(shù)計(jì)算得到DNA或RNA量是一個近似值。
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