核酸的沉降特性
溶液中的核酸分子在引力場中可以下沉。不同構象的核酸(線形,開環,超螺旋結構)、蛋白質及其他雜質在超離心機的強大引力場中,沉降的速率有很大差異,所以可以用超離心法純化核酸,或將不同構象的核酸進行分離,也可以測定核酸的沉降常數與分子量。
應用不同介質組成密度梯度進行超離心分離核酸時,效果較好。 RNA 分離常用蔗糖梯度。分離 DNA 時用得最多的是氯化銫梯度。氯化銫在水中有很大的溶解度。可以制成濃度很高( 8mol / L )的溶液。
應用啡啶溴紅—氯化銫密度梯度平衡超離心,很容易將不同構象的 DNA 、 RNA 及蛋白質分開。這個方法是目前實驗室中純化質粒 DNA 時最常用的方法。如果應用垂直轉頭,當轉速為 65 000r/min ( Beckman L-70 超離心機),只要 6h 即可以完成分離工作。但是如果采用角轉頭,轉速為 45 000r/min 時,則需 36h 。離心完畢后,離心管中各種成分的分布可以在紫外光照射下顯示得一清二楚 。蛋白質漂浮在最上面, RNA 沉淀在底部。超螺旋 DNA 沉降較快,開環及線形 DNA 沉降較慢。用注射針頭從離心管側面在超螺旋 DNA 區帶部位刺入,收集這一區帶的 DNA 。用異戊醇抽提收集到的 DNA 以除去染料,然后透析除 CsCl ,再用苯酚抽提 1~2 次,即可用乙醇將 DNA 沉淀出來。這樣得到的 DNA 有很高的純度, 可供 DNA 重組、測定序列及繪制限制酶圖譜等。在少數情況下,需要特別純的 DNA 時,可以將此 DNA 樣品再進行一次氯化銫密度梯度超離心分離。
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