發(fā)酵過(guò)程中無(wú)機(jī)磷的利用
實(shí)驗(yàn)原理
酵母能使蔗糖和葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生乙醇和二氧化碳。此過(guò)程與無(wú)機(jī)磷將糖磷酸化有關(guān)。
本實(shí)驗(yàn)利用無(wú)機(jī)磷與鉬酸形成的磷鉬酸絡(luò)合物能被還原劑α－1，2，4－氨基萘酚磺酸鈉還原成鉬藍(lán)的原理來(lái)測(cè)定發(fā)酵前后反應(yīng)混合物中無(wú)機(jī)磷的含量，用以觀察發(fā)酵過(guò)程中無(wú)機(jī)磷的消耗。
試劑 和器材
試劑
蔗糖；5％三氯乙酸；3mol/L硫酸和2.5％鉬酸銨等體積混合液。
磷酸鹽溶液：稱取Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 120.7g(或Na 2 HPO 4 ·2H 2 O 60g)和KH 2 PO 4 20g溶解于
蒸餾水中，定容至1000mL，在冰箱中貯存?zhèn)溆谩ＥR用前稀釋適當(dāng)倍數(shù)。
標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽溶液：將磷酸氫二鉀（KH 2 PO 4 ）在110℃烘箱中烘干2小時(shí)，冷卻后準(zhǔn)確稱取0.1098g，用蒸餾水溶解，定容到1000 mL，成為每毫升溶液含25μg無(wú)機(jī)磷的標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽溶液。
α－1，2，4－氨基萘酚磺酸溶液：將0.25gα－1，2，4－氨基萘酚磺酸，15g亞硫
酸氫鈉及0.5g亞硫酸鈉溶于100 mL 蒸餾水中。使用前稀釋三倍。
二、材料
新鮮啤酒酵母。
三、器材
試管 1.5×15cm（×15）；移液管0.2mL（×2），0.5mL（×2），1mL（×2），5mL（×3）；錐形瓶50mL（×1）；水浴鍋；研缽；濾紙；分光光度計(jì)。
操作方法
一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
取9支 試管 編號(hào)后，按下表順序加入試劑：
管號(hào) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽溶液(mL) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
含磷量(μg) | 0 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 |
蒸餾水(mL) | 3.0 | 2.8 | 2.6 | 2.4 | 2.2 | 2.0 |
鉬銨酸－硫酸混合液(mL) | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
α－1，2，4－氨基萘酚磺酸鈉溶液(mL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
充分混勻后，37℃ 水浴 保溫10min | ||||||
A600 | ||||||
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以 A600 為縱坐標(biāo)，含磷量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
二、酵母發(fā)酵
稱取2 ~ 4g新鮮酵母和1g蔗糖，放入研缽內(nèi)仔細(xì)研碎。加入5mL蒸餾水和5mL磷酸鹽溶液研磨均勻。將勻漿轉(zhuǎn)移至50mL 錐形瓶中并立即取出0. 5mL均勻的懸浮液，加入到已盛有3.5mL三氯乙酸溶液的試管中，搖勻作為試樣1。將錐形瓶放入37℃恒溫 水浴 中，每隔30分鐘取出0. 5mL懸浮液，立即加入已盛有3. 5mL三氯乙酸溶液的試管中，搖勻。共取三次，作為試樣2，3，4。將每個(gè)試樣過(guò)濾后，得無(wú)蛋白濾液備用。
三、無(wú)機(jī)磷的測(cè)定
取五只干燥潔凈的試管，編號(hào)后按下表加入各種溶液：
管號(hào) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
發(fā)酵時(shí)間(min) | 0 | 30 | 60 | 90 | — |
無(wú)蛋白濾液(mL) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | — |
蒸餾 水(mL) | 2.9 | 2.9 | 2.9 | 2.9 | 2.9 |
鉬銨酸－硫酸混合液(mL) | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
α－1，2，4－氨基萘酚磺酸鈉溶液(mL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
充分混勻后，37℃水浴保溫10min | |||||
A660 | |||||
從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查處各試樣的無(wú)機(jī)磷含量，以試樣1的無(wú)機(jī)磷含量為100％，計(jì)算酵母發(fā)酵30、60和90分鐘后消耗無(wú)機(jī)磷的相對(duì)百分?jǐn)?shù)。
注意事項(xiàng)
在本實(shí)驗(yàn)的預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)首先摸索酵母的用量及磷酸鹽的稀釋倍數(shù)。使光吸收值在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。
北京天優(yōu)福康生物科技有限公司
官網(wǎng)：http://www.gzs9.cn/
服務(wù)熱線：400-860-6160
聯(lián)系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
