DC與CIK共培養(yǎng)對肝癌細(xì)胞殺傷活性的研究
【摘要】 本研究的目的是觀察細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）與同源樹突狀細(xì)胞（DC）共培養(yǎng)后DC-CIK細(xì)胞的增殖活性、表型的變化，及其對肝癌細(xì)胞細(xì)胞毒作用的影響。采集健康供者的外周血單個核細(xì)胞（MNC），置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時，收集非貼壁細(xì)胞用于誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞，貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)分化出成熟DC，將成熟DC和CIK細(xì)胞按1∶5的比例混合培養(yǎng)3天，用MTT法檢測DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞殺傷SMMC-7721肝癌細(xì)胞株的活性。結(jié)果顯示： DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后，DC-CIK細(xì)胞群的增殖活性和殺傷活性較單純的CIK細(xì)胞更高。結(jié)論： DC與CIK共培養(yǎng)細(xì)胞是一種增殖活性和細(xì)胞毒活性均高于CIK細(xì)胞的免疫活性細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】 肝癌細(xì)胞
近年來隨著細(xì)胞免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，惡性腫瘤的細(xì)胞免疫治療已經(jīng)開始在臨床應(yīng)用，并取得一定療效。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cell，CIK）是一種高效、新型免疫活性細(xì)胞，是惡性腫瘤過繼免疫治療的重要手段之一。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原呈遞細(xì)胞（APC），它通過處理、呈遞抗原，介導(dǎo)機體免疫應(yīng)答。由于許多腫瘤宿主缺乏功能性DC而不能誘發(fā)抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答，故在體外誘導(dǎo)功能性DC用于主動免疫治療具有重要的臨床應(yīng)用價值。本實驗將成熟DC和CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察DC-CIK細(xì)胞群的增殖活性和表型變化，及其對肝癌細(xì)胞的體外殺傷作用。
材料和方法
主要試劑和儀器
IMDM完全培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，10%AB滅活血清為南京紅十字血液中心產(chǎn)品，AIM-V無血清培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，淋巴細(xì)胞分離液購自上海第二制藥廠，CD3單克隆抗體購自O(shè)rtho Biotech公司，IFN-α1b購自上海生物制品研究所，rhIL-2購自Chiron公司，rhGM-CSF，rhIL-1β，rhIL-4，rhIL-6，TNF-α和PGE-2均購自PEPRO Tech公司，MTT購自R＆D Systems公司）。正常人外周血取于4名健康供者。肝癌細(xì)胞株SMMC-7721為本實驗室液氮保存株。流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品，透射電鏡為HITACHI公司產(chǎn)品。
CIK細(xì)胞的體外誘導(dǎo)和擴增
通過血細(xì)胞分離機從健康供者采集外周血單個核細(xì)胞（MNC），用淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）分離出MNC，用AIM-V無血清培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為（4-6）×106/ml，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時。收集非貼壁細(xì)胞，用含10%人AB血清的IMDM調(diào)細(xì)胞濃度為（1-2）×106/ml，并加入1 000 U/ml的IFN-α懸浮培養(yǎng)，24小時后加入1 μg/ml的CD3單克隆抗體和1 000 U /ml的rhIL-2，每隔3天半量換液1次，補充rhIL-2，調(diào)整細(xì)胞濃度始終為（1-2）×106/ml。
DC的體外培養(yǎng)
在PBMNC培養(yǎng)2小時之后的貼壁細(xì)胞中，加入含1 000 U /ml的GM-CSF和1 000 U /ml的IL-4的 AIM-V培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3天換液1次并補充細(xì)胞因子，第6天加入上述細(xì)胞因子的同時還加入IL-1β、TNF-α、PGE-2等細(xì)胞因子誘導(dǎo)DC成熟，共培養(yǎng)8-9天。
DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)
收獲的DC計數(shù)后和CIK按1∶5混合培養(yǎng)，共培養(yǎng)3天。
CIK及DC-CIK對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的MTT測定
以培養(yǎng)12天的CIK、DC-CIK共培養(yǎng)物作為效應(yīng)細(xì)胞，SMMC-7721肝癌細(xì)胞株為靶細(xì)胞。取對數(shù)生長期7721肝癌細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×105/ml，CIK、DC-CIK的細(xì)胞濃度分別調(diào)整為2.5×105/ml、5×105/ml、1×106/ml、2×106/ml，效靶比依次為為2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1，實驗分3組，每組3個復(fù)孔，實驗組加效、靶細(xì)胞各100 μl/well，靶細(xì)胞組加入靶細(xì)胞、IMDM培養(yǎng)液各100 μl/well，效應(yīng)細(xì)胞組加入效應(yīng)細(xì)胞、IMDM培養(yǎng)液各100 μl/well，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時，加入MTT試劑20 μl/well 37℃孵育4小時，再加入detergent reagent 100 μl/well 37℃孵育2小時，待充分溶解沉淀后于酶聯(lián)免疫檢測儀（波長570 nm）檢測吸光度（A），計算殺傷率。計算公式為：
殺傷率=［1-（A實驗孔-A效應(yīng)孔/A靶細(xì)胞孔）］×100%
CIK、 DC、DC -CIK細(xì)胞群表型檢測
在DC培養(yǎng)的第9天用流式細(xì)胞儀進行免疫表型分析，在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第9、14、21天分別取少量細(xì)胞進行流式細(xì)胞術(shù)測定，DC-CIK共培養(yǎng)物共培養(yǎng)3天后進行流式細(xì)胞術(shù)測定。
DC透射電鏡觀察
將誘導(dǎo)培養(yǎng)至第9天的DC收獲，取1×106個細(xì)胞懸液，離心，細(xì)胞沉淀用2.5%戊二醛及1.0%的鋨酸固定，經(jīng)乙醇梯度脫水，超薄切片鉛鈾染色后置透射電鏡下觀察。
統(tǒng)計學(xué)處理
采用SAS軟件進行t檢驗。
結(jié)果
細(xì)胞的增殖情況及形態(tài)觀察
CIK和DC-CIK的增殖活性
培養(yǎng)細(xì)胞在第3天開始出現(xiàn)增殖，第5天以后進入快速增殖期。DC-CIK共培養(yǎng)3天后，增殖速度明顯快于單純CIK細(xì)胞組（P<0.05），培養(yǎng)第17天時兩者增殖倍數(shù)相差1倍多。倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈集落樣懸浮生長，細(xì)胞體積明顯增大，培養(yǎng)期內(nèi)細(xì)胞存活率均95%以上。
DC的增殖
培養(yǎng)的第2-3天細(xì)胞開始出現(xiàn)變形，拉長呈梭形、細(xì)樹枝狀及放射狀等各種不規(guī)則形態(tài)，部分細(xì)胞開始懸浮，貼壁細(xì)胞部分聚集成團；培養(yǎng)5-6天后，集落明顯增多，且有更多的細(xì)胞處于輕貼壁狀態(tài)；培養(yǎng)7-9天成熟后，大部分細(xì)胞開始懸浮，形態(tài)不規(guī)則，倒置顯微鏡下可觀察到大量具有毛刺狀突起的細(xì)胞，形態(tài)不規(guī)則，為典型的DC形態(tài)，有的細(xì)胞表面有圓形、星形及樹突樣突起。
DC的超微結(jié)構(gòu)觀察
透射電鏡下，DC細(xì)胞表面有大量粗細(xì)不等的樹枝狀突起，胞體大，胞內(nèi)線粒體豐富，溶酶體少見甚至沒有，細(xì)胞核大而不規(guī)則，呈馬蹄形、腎形或不規(guī)則型，核內(nèi)異染色質(zhì)明顯邊集。
細(xì)胞的表型分析
CIK表型分析
經(jīng)流式細(xì)胞儀分析表明，CIK細(xì)胞屬于異質(zhì)細(xì)胞群，隨著培養(yǎng)時間的延長，CIK細(xì)胞中CD3+CD8+ 、CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞的百分含量大幅度上升。與DC共培養(yǎng)的CIK細(xì)胞CD3+CD8+、CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞的百分含量進一步升高，經(jīng)DC作用的CIK細(xì)胞與單純CIK細(xì)胞CD3+CD8+、CD3+CD56+的表達差異顯著。
DC表型分析
誘導(dǎo)成熟的DC經(jīng)流式細(xì)胞儀分析顯示，有（83.65±1.41）%的細(xì)胞表達DC特異性表面標(biāo)志CD1a，有（82.40±2.33）%的細(xì)胞表達成熟DC特異性表面標(biāo)志CD83，（97.46±1.03）%的細(xì)胞表達HLA-DR，（96.39±0.83）%的細(xì)胞表達CD80，（96.35±1.14）%的細(xì)胞表達CD86，（87.35±2.04）% 的細(xì)胞表達CD40，只有（3.79±1.28）%的細(xì)胞表達CD14。這些均說明外周血單核細(xì)胞經(jīng)一定的細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)后，可以生成高純度的成熟的DC。
DC-CIK共培養(yǎng)物和CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性
體外實驗表明： PBMNC在培養(yǎng)前的細(xì)胞毒活性很低，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞毒活性逐漸增強，14-21天時達高峰，以后逐漸下降。以肝癌細(xì)胞7721為靶細(xì)胞，在2 .5-20效靶比范圍內(nèi)，DC-CIK共培養(yǎng)物對7721的殺傷活性均高于單純CIK細(xì)胞組，且差異顯著（P<0.05）。
討論
CIK細(xì)胞是一種非MHC限制性的高效溶腫瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其在外周血淋巴細(xì)胞中的比例為1%-5%。1991年，Schmidt-wolf等首先報道了CIK細(xì)胞。CIK細(xì)胞是人外周血單個核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激后獲得的一群異質(zhì)性細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞表面既有T細(xì)胞表面標(biāo)志（CD3），也有NK細(xì)胞表面標(biāo)志（CD56），因而兼有T淋巴細(xì)胞抗瘤活性和NK細(xì)胞非MHC限制性殺瘤的特點。應(yīng)用CIK細(xì)胞治療克服了過去過繼免疫療法的不足，如體外增殖數(shù)量少、需輸注IL-2、低效及副作用大等，現(xiàn)已經(jīng)成為腫瘤生物治療的一種新方法。
樹突狀細(xì)胞（DC）是機體內(nèi)最重要的、功能最強的抗原呈遞細(xì)胞（APC），最初是Steinman和Cohn等于1973年從小鼠脾組織中分離發(fā)現(xiàn)的。DC最大的特點是能激活初始型T細(xì)胞增殖并建立初級免疫應(yīng)答；DC 激發(fā)T細(xì)胞增殖及抗原呈遞能力是巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的100-1 000倍。以外周血單核細(xì)胞為DC前體細(xì)胞誘導(dǎo)DC，是體外大量生成DC的一條重要途徑。GM-CSF可促進髓系細(xì)胞發(fā)育，是生成和維持DC發(fā)育和分化的最根本的細(xì)胞因子；IL-4抑制粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，促進單核細(xì)胞向DC的轉(zhuǎn)化，并維持DC成熟；TNF-α和PGE2可阻止粒系的分化而刺激DC的成熟并增強其抗原呈遞能力。
Marten等將CIK和同源DC共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，DC分泌IL-12明顯增加，并使CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性明顯增強。阻斷IL-12對CIK細(xì)胞的作用，可以使CIK殺傷活性明顯減低。我們的實驗研究表明，DC-CIK細(xì)胞群比同源CIK細(xì)胞具有更強的增殖活性，共培養(yǎng)1周后DC-CIK的擴增倍數(shù)比同源CIK高約1倍。Zoll等的研究表明，IL-2和 IL-12對CIK細(xì)胞有促增殖作用，且IL-12使CIK細(xì)胞高表達對殺瘤活性起重要作用的CD56+細(xì)胞。成熟DC自身可分泌高水平的IL-2、IL-12和IFN-γ等細(xì)胞因子，因此與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后可提高CIK的增殖活性和細(xì)胞毒作用，這對于腫瘤臨床具有重要意義。
DC與CIK共培養(yǎng)過程中，CIK細(xì)胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+的比例較單純CIK細(xì)胞有不同程度的增高，說明大量成熟DC進一步促進了CIK細(xì)胞的成熟。目前關(guān)于CIK殺傷靶細(xì)胞的原理尚未完全闡明，可能是通過黏附因子LFA/ICAM-1途徑與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后，分泌含大量BLT酯酶的顆粒，這些顆粒能穿透靶細(xì)胞膜，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的裂解；而且CIK細(xì)胞還能分泌IL-2，IL-6，TNF-α及GM-CSF等一些細(xì)胞因子，增強細(xì)胞毒作用；此外，CIK細(xì)胞還可通過直接靶向腫瘤細(xì)胞進行殺傷或誘導(dǎo)其凋亡。DC能進一步提高CIK對靶細(xì)胞的殺傷活性，其機制可能為： ①DC能分泌多種細(xì)胞因子，如IL-2、IL-12、IFN-γ等，促進CIK成熟； ②DC分泌高水平的IL-12，誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，有利于清除腫瘤細(xì)胞。因此，在今后的腫瘤臨床治療中，用DC-CIK回輸治療要優(yōu)于直接CIK治療或DC治療。因為，DC和CIK同時回輸，已活化的CIK可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而DC可繼續(xù)活化體內(nèi)的T細(xì)胞，從而發(fā)揮較持久的抗腫瘤作用。
本研究表明，DC-CIK共培養(yǎng)能提高CIK對SMMC-7721肝癌細(xì)胞的殺傷活性，其殺瘤作用較單純CIK細(xì)胞更強。本研究為DC-CIK應(yīng)用于肝癌臨床治療提供了可靠的依據(jù)，是將主動特異性免疫治療和過繼免疫治療相結(jié)合產(chǎn)生更有效的腫瘤免疫治療方法的新的探索。
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