重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化、復(fù)性和定量
一、重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)
1.挑取轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的單菌落，接種于3ml 選擇性L(fǎng)B液體培養(yǎng)基中，37 o C，250 rpm/min振搖培養(yǎng)過(guò)夜。
2.次日將培養(yǎng)過(guò)夜的菌液500 μl再接種于10 ml（1: 20）選擇性L(fǎng)B液體培養(yǎng)基中，37 o C，250 rpm/min振搖培養(yǎng)至光密度（OD600 =0.6）時(shí)，取1 ml樣本作為誘導(dǎo)前標(biāo)本，10000g離心1 min收集菌體沉淀，－20 o C凍存?zhèn)溆谩?/span>
3.加入1 mol/L IPTG于菌液中，使IPTG終濃度為1 mM，37 o C，250 rpm/min振搖培養(yǎng)4～5小時(shí)。取1 ml樣本作為誘導(dǎo)后標(biāo)本，同上法收集菌體沉淀，－20 o C凍存?zhèn)溆谩?/span>
4.將誘導(dǎo)前后菌體沉淀用20 ~ 40 μl PBS（pH= 8.0）重懸，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸加熱5 min，SDS聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色3小時(shí)后，脫色觀察結(jié)果。
5.選取誘導(dǎo)成功的細(xì)菌克隆，擴(kuò)大誘導(dǎo)規(guī)模，收集菌體沉淀，于－20 o C保存，準(zhǔn)備做下一步分析及純化。
二、重組蛋白質(zhì)的分離純化
重組蛋白質(zhì)的可溶性鑒定
1.將按上法誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集的菌體重懸于裂解液1 (Lysis buffer under native conditions )中，然后在－80 o C低溫冰箱中放置10 min。
2.冰中解凍。
3.在冰浴上用超聲破碎儀破菌6次，每次10 sec，間歇10 sec，電壓200-300 V。
4.10000g，4o C，離心20 min，取上清（為溶液A），－20 o C保存；另將沉淀用同樣裂解液1溶解（為溶液B），同樣－20 o C保存，供后繼分析使用。
5.將上述A、B溶液和誘導(dǎo)前后的細(xì)菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，比較分析重組蛋白質(zhì)的溶解性。如果誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)位于A溶液中，則為可溶性蛋白；如果是在B溶液中，則為非可溶蛋白。
重組蛋白質(zhì)為非可溶性蛋白（變性條件下）的分離純化
1. 將菌體沉淀溶于適量裂解液2（Lysis buffer under denaturing conditions）中，室溫下攪拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。
2. 10000g，4 o C，離心30 min，收集上清液。
3. 將Ni-NTA Agarose充填柱子，并連接于Pharmarcia低壓液相層析系統(tǒng)，用5倍柱體積的裂解液2平衡Ni-NTA Agarose，調(diào)節(jié)A280 值至零線(xiàn)。
4. 將適量上清液上樣到Ni-NTA Agarose柱子中，并用lysis buffer沖洗至A280 值低于0.01。
5. 分別用5～10倍柱體積的清洗液1 和清洗液2（Wash buffer 1 and 2）清洗柱子，直至A280 值低于0.01。
6.用洗脫液（Elution buffer）洗脫重組蛋白質(zhì)，在A280 值監(jiān)測(cè)下，收集出現(xiàn)峰線(xiàn)后含有重組蛋白的所有洗脫液。
三、重組蛋白質(zhì)的復(fù)性、凍干和定量
純化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液緩慢透析，最終用0.01×PBS透析，透析后的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)凍干成粉狀。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)，采用BIO-RAD公司蛋白質(zhì)定量試劑(protein assay)比色測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。
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