糖糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定酵解中間產(chǎn)物的鑒定
一 、 實驗?zāi)康?/span>
了解糖酵解過程的某一中間步驟及利用抑制劑來研究中間代謝的方法。
二 、 實驗原理
利用碘乙酸對糖酵解過程中3-磷酸苷油醛脫氫酶的抑制作用，使3-磷酸苷油醛不再向前變化而積累。硫酸肼作為穩(wěn)定劑，用來保護3-磷酸苷油醛是不自發(fā)分解。然后用2，4-二硝基苯肼與3-磷酸苷油醛在堿性條件下形成2，4-二硝基苯肼-丙糖的棕色復(fù)合物，其棕色程度與2-磷酸苷油醛含量成正比。
三 、 儀器 原料和試劑
（1）儀器：試管（1.5×1.5cm）、吸量管（1ml、、2ml3ml）、恒溫水浴、燒杯（50ml）。
（2）原料：新鮮酵母。
（3）試劑：
①2，4-二硝基苯肼：0.1g2，4-二硝基苯肼溶于水100ml 2mol/L鹽酸溶液中，貯于棕色瓶中備用。
②0.56mol/L硫酸肼溶液：稱取7.28g硫酸肼溶于50ml水中，這時不會全部溶解，當(dāng)加入NaOH使pH達7.4時則完全溶解。此液也可用于水合肼溶液配制，可按其分子 濃度稀釋至0.56mol/L，此時溶液呈堿性，可用濃硫酸調(diào)pH至7.4即可。
③5%葡萄糖溶液。
④10%三氯乙酸溶液。
⑤0.75mol/LNaOH溶液。
⑥0.002mol/L碘乙酸溶液。
四、操作步驟
（1）取小燒杯3只，分別加入新鮮酵母0.3g，并按下表分別加入各試劑，混勻。
| 杯號 | 5%葡萄糖加入量/ml | 10%三氯醋酸加入量/ml | 碘乙酸加入量/ml | 硫酸肼加入量/ml | 發(fā)酵時起泡多少 |
| 1 | 10 | 2 | 1 | 1 | |
| 2 | 10 | -- | 1 | 1 | |
| 3 | 10 | -- | -- | -- |
（2）將各杯混合物分別倒入編號相同的發(fā)酵罐 內(nèi)，放入37℃保溫1.5h，觀察發(fā)酵管產(chǎn)生氣泡的量有何不同。
（3）把發(fā)酵管中發(fā)酵液傾倒入同號小燒杯中并在2號和3號杯中按下表補加各試劑，搖勻放10min后和第一只燒杯中內(nèi)容物一起分別過濾，取濾液進行測定。
| 杯號 | 10%三氯乙酸/ml | 碘乙酸/ml | 硫酸肼/ml |
| 2 | 2 | -- | -- |
| 3 | 2 | 1 | 1 |
（4）取3個試管，分別加入上述濾液0.5ml，并按下表加入試劑和處理。
管號 | 濾液/ml | 0.75mol/L NaOH/ml | 室溫放置 10min | 2，4-二硝基苯肼/ml | 38℃水浴保溫19min | 0.75mol/L NaOH/ml | 觀察結(jié)果 |
| 1 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 3.5 | |||
| 2 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 3.5 | |||
| 3 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 3.5 |
五 、 思考題
實驗中哪一發(fā)酵管生成的氣泡最多？哪一管最后生成的顏色最深？為什么？
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