Folin-酚試劑法(Lowry法)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度
[目的]
掌握Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理。
[原理]
蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與Cu 2+ 螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚 試劑 的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在一定條件下，利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。
[操作]
取試管7支、編號(hào)、按下表操作：
立即混勻，在20℃～25℃水浴保溫30分鐘。用660nm比色，測(cè)定光密度值。
操作注意事項(xiàng)：
1． 按順序添加 試劑
2． 試劑乙在酸性條件下穩(wěn)定，堿性條件下（試劑甲）易被破壞，因此加試劑乙后要立即混勻，加一管混勻一管，使試劑乙（磷目酸）在破壞前即被還原。
[計(jì)算]
(一)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(二)以測(cè)定管光密度值，查找標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度(g／L)。
(三)再從標(biāo)準(zhǔn)管中選擇—管與測(cè)定管光密度相接近者，求出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度(g／L)。
[器材]
(一)721型分光光度計(jì)
(二)恒溫水浴箱
(三)中 試管 7支
(四)刻度吸管：1. 0ml二支；0.5ml一支；5.0ml一支。
[試劑]
(一)試劑甲
(1)4％碳酸鈉(Na 2 CO 3 )溶液
(2)0.2N氫氧化鈉溶液
(3)1％硫酸銅溶液(CuSO 4 ·5H 2 O)
(4)2％酒石酸鉀鈉溶液(或酒石酸鉀或鈉)
在使用前(1)與(2)、(3)與(4)等體積混合，再將兩混合液按50：1比例混合，即為試劑甲。該試劑只能用一天，過期失效。
(一)試劑乙：
(1)市售酚試劑在使用前用NaOH滴定，以酚肽為指標(biāo)劑，根據(jù)試劑酸度將其稀釋，使最后酸度為1N。
(2)或取Na 2 WoO 4 2H 2 O l00g和Na 2 MOO 3 25g。溶于 蒸餾 水700ml中，再加85％ H 3 PO 4 50ml和HCl(濃)100ml，將上物混合后，置1000ml圓底燒瓶中溫和地回流十小時(shí)，再加硫酸鋰(Li2SO4H2O)150g，水50ml及溴水?dāng)?shù)滴。繼續(xù)沸騰15分鐘后以除去剩余的溴，冷卻后稀釋至1000ml然后過濾，溶液應(yīng)呈黃色或金黃色(如帶綠色者不能用)，置于棕色瓶中保存，使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，以酚酞為指示劑，而后稀釋約一倍，使最后酸度為1N。
(三)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液
用結(jié)晶牛血清白蛋白，根據(jù)其純度用 蒸餾 水配制成0.25mg／ml的蛋白質(zhì)溶液。(純度可經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量而確定)。
(四)待測(cè)樣品：準(zhǔn)確取 血清 0.1ml，置于50ml 容量瓶 中，再加0.9％NaCl溶液至刻度，充分混勻，也可以用尿液為樣品。
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