離子交換樹(shù)脂層析分離混合氨基酸
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>
1. 了解離子交換樹(shù)脂層析的工作原理及操作技術(shù)。
2. 學(xué)會(huì)用離子交換樹(shù)脂層析法分離混合氨基酸。
【實(shí)驗(yàn)原理】
離子交換樹(shù)脂是一種合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨脹。高聚物分子 由能電離的性基團(tuán)及非極性的樹(shù)脂組成。極性基團(tuán)上的離子能與溶液中的離子起交換作用，而非極性的樹(shù)脂本身物性不變。通常離子交換樹(shù)脂按所帶的基團(tuán)分為強(qiáng)酸(＝R＝S03H)、弱(＝COOH)、強(qiáng)堿(＝N+＝R：)和弱堿(＝NH2＝NHR＝NR2)。
離子交換樹(shù)脂分離小分子 物質(zhì)如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比較理想的。但對(duì)生物大于物質(zhì)如蛋白質(zhì)是不適當(dāng)?shù)模驗(yàn)樗鼈儾荒軘U(kuò)散到樹(shù)脂的鏈狀結(jié)構(gòu)中。故如分離生物大子、可選用以多糖聚合物如纖維素、葡聚糖為載體的離子交換劑。
本實(shí)驗(yàn)用磺酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)堿性氨基酸(賴(lài)氨酸)的混合液。在特定的pH條件下，它們解離程度不同，通過(guò)改變脫液的pH或離子強(qiáng)度可分別洗脫分離。
【實(shí)驗(yàn)材料】
1．實(shí)驗(yàn)器材
層析柱 （1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；試管及試管架；紫外分光光度計(jì)、磺酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(Dowex 50)
2．實(shí)驗(yàn)試劑
(1)2mol／L HCl
(2)2mol／L NaOH
(3)0.1mOl／L HCl
(4) 0.1mol／L NaOH
(5)pH4.2的檸檬酸緩沖液：0.lmol／L檸檬酸54m1加0.1mol／L檸檬酸鈉46ml
(6)pH5的醋酸緩沖液：0.2mol／L NaAc 70ml加0.2mol／L HAc 30ml
(7)0.2％中性茚三酮溶液：0.2g茚三酮加100ml丙酮
(8)氨基酸混合液：丙氨酸、天冬氨酸、賴(lài)氨酸各10m1加0.1mol／L HCl 3m
【實(shí)驗(yàn)方法】
1. 樹(shù)脂的處理
100ml燒杯中置約10g樹(shù)脂，加25ml 12mo1／L HCl攪拌2h，傾棄酸液，用蒸餾水充洗滌樹(shù)脂至中性。加25ml 12mol／L NaOH至上述樹(shù)脂中攪拌2h，傾棄堿液，用蒸餾水洗滌至中性。將樹(shù)脂懸浮于50ml pH4.2檸檬酸緩沖液中備用。
2. 裝柱
取直徑0.8cm～1.2cm、長(zhǎng)度10cm～12cm的層析柱，底部墊玻璃棉或海綿圓墊，自頂部注入經(jīng)處理的上述樹(shù)脂懸浮液，關(guān)閉層柱出口，待樹(shù)脂沉降后，放出過(guò)量的溶液，在加入一些樹(shù)脂，至樹(shù)脂沉積至8cm～10cm高度即可。于柱子頂部繼續(xù)加入pH4.2檸檬酸緩沖液洗滌，使流出液pH為4.2為止，關(guān)閉柱子出口，保持液面高出樹(shù)脂表面1cm左右。
3. 加樣、洗脫及洗脫液收集
打開(kāi)山口使緩沖液流出，待液面幾乎平齊樹(shù)脂表面時(shí)關(guān)閉出口(不可使樹(shù)脂表面干燥)。用長(zhǎng)滴管將15滴氨基酸混合液仔細(xì)直接加到樹(shù)脂頂部，打開(kāi)出口使其緩慢流入柱內(nèi)。
當(dāng)液面剛平樹(shù)脂表面時(shí)，加入0.1mol／L HCl 3ml，以10滴／min～12滴／min的流速洗脫，收集洗脫液，每管20滴，逐管收存。當(dāng)HCl液面剛平樹(shù)脂表面時(shí)，用1m1 pH4.2檸檬酸緩沖液沖洗柱壁一次，接著用2ml pH4.2檸檬酸緩沖液洗脫，保持流速10滴／min～12滴／min并注意勿使樹(shù)脂表面干燥。
在收集洗脫液的過(guò)程中，逐管用茚三酮檢驗(yàn)氨基酸的洗脫情況，方法是：于各管洗脫液中加10滴pH5醋酸緩沖液和10滴中性茚三酮溶液，沸水浴中煮10min，如溶液呈紫藍(lán)色，表示已有氨基酸洗脫下來(lái)。顯色的深度可代表洗脫的氨基酸濃度，可比色測(cè)。
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