DNA的聚合反應(yīng)和DNA聚合酶
1957年，Arthur kornberg首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅰ，(DNa polymerase Ⅰ,簡寫DNA polⅠ)后來又相繼發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。(DNa polymerase Ⅱ，Ⅲ，簡寫DNA polⅡ,DNA polⅢ)實(shí)驗(yàn)證明大腸桿菌中DNA復(fù)制的主要過程靠DNa polⅢ起作用，而DNA polⅠ和DNA polⅡ在DNA錯(cuò)配的校正和修復(fù)中起作用。
這種酶的共同性質(zhì)是：
①需要DNA模板，因此這類酶又稱為依賴DNA的DNA聚合酶(DNa dependent DNA polymerase, DDDP)。
②需要RNA或DNA做為引物(primer)，即DNA聚合酶不能從頭催化DNA的起始。
③催化dNTP加到引物的3′H末端，因而DNA合成的方向是5′→3′。
④三種DNA聚合酶都屬于多功能酶，它們在DNA復(fù)制和修復(fù)過程的不同階段發(fā)揮作用。由于DNA聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特點(diǎn)，所以我們著重介紹DNa polⅠ的作用并指出另外二種DNA pol的特殊性：
1.DNA聚合酶Ⅰ：
DNA polⅠ是由一條多肽鏈組成，分子量為109KD。酶分子中含有一個(gè)Zn++，是聚合活性必須的。
大腸桿菌每個(gè)細(xì)胞中約有400個(gè)酶分子，每個(gè)酶分子每分鐘在37℃下能催化667個(gè)核苷酸參入到DNA鏈中，用枯草桿菌蛋白酶可將此酶水介成兩個(gè)片段，大片段分子量為76KD，通常稱為klenow片段，小片段為34KD。大小片段具有不同的酶活性。
(1)DNA聚合酶的5′→3′聚合活性：
這是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸順序，將互補(bǔ)的dNTP逐個(gè)加到引物RNA3′H末端，并促進(jìn)3′H與dNTP的5′O4形成磷酸二酯鍵，酶的專一性表現(xiàn)為新進(jìn)入的dNTP必須與模板DNA堿基配對時(shí)才有催化作用，5′→3′聚合活性存在于klenow片段上。
(2)DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性：
這種酶活性的主要功能是從3′→5′方向識(shí)別并切除DNA生長鏈末端與模板DNA不配對而游離的核苷酸，這種功能稱為校對功能，這是保證其聚合作用的正確性不可缺少的，因此對于DNA復(fù)制中極高的保真性是至關(guān)重要的。
(3)DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性：
這種酶活性是從DNA鏈的5′端向3′末端水解已配對的核苷酸，本質(zhì)是切斷磷酸二酯鍵，每次能切除10個(gè)核苷酸。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起重要作用，對完成的DNA片段去除5′端的RNA引物也是必須的。
DNA polⅠ的5′→3′聚合活性和5′→3′外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA一條鏈上的切口從5′→3′方向移動(dòng)，這種反應(yīng)叫做缺刻平移(nick translation)，利用此反應(yīng)可在體外對DNA片段進(jìn)行放射性磷(α-32PdNTP)的標(biāo)記制成探針(probe)，進(jìn)行核酸的分子雜交實(shí)驗(yàn)，是現(xiàn)代分子生物學(xué)的一項(xiàng)重要技術(shù)。
許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)DNA polⅠ并不是DNA復(fù)制過程中的主要酶，它的作用主要與DNA損傷后的修復(fù)有關(guān)。
2.DNA聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ)
此酶分子量為120KD，每個(gè)細(xì)胞約有100個(gè)酶分子，但活性只有DNa polⅠ的5%，它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，而沒有5′→3′外切活性，它的作用可能與DNA損傷修復(fù)有關(guān)。
3.DNA聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ)
這是在DNA復(fù)制過程中起主要作用的聚合酶，它是由一個(gè)多亞基組成的蛋白質(zhì)分子，其分子量＞600kDa整個(gè)酶分子形成一個(gè)不對稱的二聚體，每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中只有10?0個(gè)酶分子，但催化dNTP參入DNA鏈的速率卻是最快的，約為9000核苷酸/每分鐘/每個(gè)酶分子。
這也證明DNa polⅢ是DNA復(fù)制過程中主要發(fā)揮作用的酶。在大腸桿菌染色體DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是單獨(dú)起作用的，而是與引發(fā)體，介鏈酶等構(gòu)成一個(gè)復(fù)制體(replisome)。由于復(fù)制體的存在，先導(dǎo)鏈和隨從鏈可以同時(shí)復(fù)制。
DNa polⅢ是由多亞基組成的不對稱二聚體，它可能同時(shí)負(fù)責(zé)先導(dǎo)鏈和隨從鏈的復(fù)制，在φ×174的復(fù)制中觀察到引發(fā)體總是伴隨著DNA嚕噗(loop)的存在。
可以看到，由于隨從鏈的模板DNA在DNA聚合酶Ⅲ全酶上繞轉(zhuǎn)了180°而形成一個(gè)嚕噗，因此崗崎片段的合成方向能夠與先導(dǎo)鏈的合成方向以及復(fù)制體移動(dòng)方向保持一致。
隨著DNA polⅢ向前移動(dòng)，先導(dǎo)鏈的合成逐漸延長的同時(shí)，崗崎片段也在不斷延長，這一嚕噗也在不斷擴(kuò)大。當(dāng)崗崎片段合成到前一個(gè)片段的5′端時(shí)，這一大嚕噗就釋放出來，由于復(fù)制叉向前移動(dòng)又可將另一部分隨從鏈的模板置換出來，由引發(fā)體合成新的引物，然后再形成一個(gè)小的嚕噗，進(jìn)行新的崗崎片段的合成。
由此模型不難看出：隨從鏈的合成需要周期性的引發(fā)，因此其合成進(jìn)度總是與前導(dǎo)鏈相差一個(gè)崗崎片段的長度。崗崎片段完成后，其5′端的RNA引物由DNa polⅠ的5′→3′
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