載量和上樣量
在做層析實(shí)驗(yàn)的時(shí)候可能時(shí)常會(huì)遇到一個(gè)問(wèn)題：一次實(shí)驗(yàn)可以上多少樣品呢？多也不是少也不是，上樣多了會(huì)造成一部分樣品損失或者達(dá)不到預(yù)期的分離效果，上樣少了無(wú)法充分使用層析柱還要增加重復(fù)實(shí)驗(yàn)或者使用更大層析柱，真是件糾結(jié)的事情。我們今天要來(lái)給大家介紹的就是不同的層析柱應(yīng)該如何確定上樣量。
層析柱上樣量由柱體積和所使用填料載量決定
● 柱體積（CV）：層析柱中裝填的填料的總體積，根據(jù)層析柱的截面積及填料裝填的高度計(jì)算得到。
● 載量：填料在一定條件下填料結(jié)合目的分子的能力，分為靜態(tài)載量和動(dòng)態(tài)載量。
靜態(tài)載量（有效載量）：
在一定的條件下，可以結(jié)合在層析填料上的真實(shí)樣品的數(shù)量，它是使用真實(shí)的樣品和介質(zhì)充分浸潤(rùn)飽和，然后測(cè)定結(jié)合在填料上的樣品總量。pH、離子強(qiáng)度、添加劑以及樣品等因素都會(huì)影響有效結(jié)合載量。實(shí)驗(yàn)條件改變，有效結(jié)合載量也會(huì)變化。
動(dòng)態(tài)載量：
在一定的運(yùn)行條件下，可以結(jié)合在層析柱上的樣品數(shù)量。除 pH，離子強(qiáng)度，添加劑以及樣品以外，運(yùn)行流速也會(huì)影響動(dòng)態(tài)結(jié)合載量。一般來(lái)說(shuō)，流速越低，動(dòng)態(tài)結(jié)合載量越高。如果流速接近于零，動(dòng)態(tài)結(jié)合載量等于有效載量。
層析都是在一定流速下進(jìn)行的，故填料的動(dòng)態(tài)載量更能有效地用于上樣量的確定。對(duì)于特定填料或?qū)游鲋鶃?lái)說(shuō)，說(shuō)明書(shū)都會(huì)給出對(duì)于某種特定蛋白其動(dòng)態(tài)結(jié)合載量，同時(shí)給出相應(yīng)的測(cè)定條件，可作為實(shí)際實(shí)驗(yàn)中上樣量的參考。如下圖給出了 HisTrap HP 的動(dòng)態(tài)載量及測(cè)定條件：
● 若需要確定填料對(duì)于特定樣品在特定條件下的結(jié)合載量，可通過(guò)以下方法測(cè)定實(shí)際的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量：
① 步驟一：保證時(shí)間
在?KTA 上連接上相應(yīng)填料的 1 ml 的 HiTrap 的柱子或者小試的層析柱（如果涉及到工藝放大，小試的層析柱的高度應(yīng)該與工業(yè)柱子的高度一致，保證放大前后的樣品的保留時(shí)間也就是樣品與填料的接觸時(shí)間一致。
② 步驟二：充分平衡柱子
使用 5 個(gè)柱床體積的結(jié)合緩沖液（平衡緩沖液）充分平衡柱子。
③ 步驟三：計(jì)算動(dòng)態(tài)載量
在一定的流速下（例如：線性流速 300 cm/h）連續(xù)上樣（真實(shí)的樣品），并且使用收集器收集穿透液，測(cè)定穿透液中的目標(biāo)蛋白的含量或者活性。
上樣剛開(kāi)始，280nm 曲線（A280）升高，此時(shí)目標(biāo)蛋白大部分結(jié)合在柱子上，所以幾乎檢測(cè)不到目標(biāo)活性（Activity）；隨著上樣體積的增加，漸漸達(dá)到柱子的載量，可以在穿透曲線中檢測(cè)到目標(biāo)蛋白的活性。計(jì)算 QB,5%，即得到在一定流速下，一定緩沖液條件下的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量，其計(jì)算公式為：
C0 = 樣品中目標(biāo)蛋白的濃度（concentration of target solute in feed）。
VA = 穿透曲線中目標(biāo)樣品活性達(dá)到 5% C0 時(shí)上樣的總體積（volume applied until the conc. Of target solute in effluent has reached 5% of C0）。
VC = 總的柱床體積（total bed volume）。
QB,5%： 一般可以根據(jù)真實(shí)的目標(biāo)或者實(shí)際工藝計(jì)算 QB,5% 或者 QB,10% 作為動(dòng)態(tài)結(jié)合載量。確定了使用的層析柱體積以及相應(yīng)填料的載量，層析過(guò)程中上樣量也就很容易確定了。
舉一反三
聊完了層析柱上樣量和體積與填料載量的關(guān)系之后，讓我們來(lái)看一看根據(jù)層析五大原理，不同類型的層析實(shí)驗(yàn)應(yīng)該如何保證上樣量呢？
⑴ 非吸附性層析 - 凝膠過(guò)濾
組分分離：如脫鹽、緩沖液置換等實(shí)驗(yàn)，上樣體積最大可達(dá) 30% 的柱體積，通常建議為 10%-20% 柱體積。
精細(xì)分離：若使用凝膠過(guò)濾進(jìn)行高分辨率的組分分離，推薦使用層析柱體積 0.5%-4% 的上樣體積，不同比例取決于層析柱的類型以及樣品性質(zhì)。通常為了得到較好的分辨率，上樣體積不超過(guò) 2% 的總柱體積。
分析分離或組分復(fù)雜的樣品分離：推薦使用 0.5% 的總柱體積上樣，可達(dá)到較好的分離效果。低于 0.5% 的樣品體積通常不能提高分辨率。
注意：由于凝膠過(guò)濾層析上樣體積受到限制，通常可對(duì)樣品進(jìn)行濃縮，濃度低于 70 mg/mL 通常是可以接受的，但要根據(jù)不同樣品具體性質(zhì)確定（考慮樣品穩(wěn)定性、樣品黏度等）。
⑵ 吸附性層析
所使用的填料載量和柱體積共同決定。
⑶ 離子交換或疏水層析
真實(shí)上樣量：對(duì)于一個(gè)給定的離子交換或疏水填料，真實(shí)上樣量一般在 5~40% 的有效載量（因?yàn)閹в型瑯有再|(zhì)電荷的雜質(zhì)也會(huì)結(jié)合在柱子上）。
上樣量：樣品越復(fù)雜，上樣的比例越小。若樣品較簡(jiǎn)單，且目標(biāo)蛋白所占比例較大，上樣量可以達(dá)到 80% 的載量。
載量與上樣百分比： 填料結(jié)合載量為 25 mg/ml 的 1 ml 的柱子，如果使用 80% 的載量，可上樣 20 mg 的樣品；若使用 40% 載量，可上樣 10 mg 樣品；若使用 5% 的載量，可上樣 1.25 mg 的樣品。
測(cè)定樣品動(dòng)態(tài)結(jié)合載量： 或者如果測(cè)定了真實(shí)樣品的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量，直接可以使用 70% 以上的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量上樣。
⑷ 親和層析
親和層析樣品的最大上樣量由填料的結(jié)合載量決定。
例如： Ni Sepharose HP 填料每毫升填料可以吸附 40 mg 的標(biāo)簽蛋白，如使用 5 ml HisTrap，樣品最大上樣量為 200 mg，若樣品的濃度為 5 mg/ml，則最大的上樣體積可以達(dá)到 40 ml。
但實(shí)際上樣量根據(jù)樣品復(fù)雜程度不同有一定差異。 另外，如果使用小柱子純化大體積的樣品，樣品的準(zhǔn)備是非常重要的，因?yàn)榇罅侩s質(zhì)可以會(huì)造成柱子堵塞，從而增加清洗成本，降低使用壽命。
專家天團(tuán)
我們的 12 位愛(ài)純派專家們專職服務(wù)于蛋白純化，或?qū)Ｗ⒀褐破罚蚓?/span>抗體純化，或潛心疫苗生產(chǎn)，更有多面手，百曉生……總有一款適合您！如果您還有針對(duì)裝柱流程的問(wèn)題，歡迎發(fā)送您的問(wèn)題到 akta.club@ge.com 提問(wèn)，您的問(wèn)題會(huì)在 48 小時(shí)之內(nèi)得到回復(fù)~
北京天優(yōu)福康生物科技有限公司
官網(wǎng)：http://www.gzs9.cn/
服務(wù)熱線：400-860-6160
聯(lián)系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
