甲基化酶（Methylase）的種類及其對限制性酶切的影響
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一、甲基化酶的種類
原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護(hù)宿主 DNA 不被相應(yīng)的限制酶所切割。在 E.coli 中，大多數(shù)都有三個(gè)位點(diǎn)特異性的 DNA 甲基化酶。
1.Dam 甲基化酶
Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。一些限制酶(PvuⅡ, BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、XhoⅡ、MboⅠ、 Sau3AⅠ)的識別位點(diǎn)中含 GATC 序列，另一些酶 ClaⅠ(1/4)、 XbaⅠ(1/16)、TaqⅠ(1/16)、MboⅠ(1/16)、 HphⅠ(1/16) 的部分識別序列含此序列，如平均 4 個(gè) ClaⅠ 位點(diǎn)(ATCGATN)中就有一個(gè)該序列。
有些限制酶對 Dam 甲基化的 DNA 敏感，不能切割相應(yīng)的序列，如 BclⅠ、 ClaⅠ、 XbaⅠ 等。對甲基化不敏感的有 BamHⅠ、 Sau3AⅠ、 BglⅡ、 PvuⅠ 等。 MboⅠ 和 Sau3AⅠ 識別和切割位點(diǎn)相同，但其差異就在于前者對甲基化敏感。
一般哺乳動(dòng)物 DNA 不會在腺嘌呤 N6 上甲基化，因此對甲基化敏感的限制酶切割這些 DNA 不會受到影響。當(dāng)需要在這些敏感位點(diǎn)上完全切割 DNA 時(shí)，可利用 dam- E.coli 擴(kuò)增并提取 DNA 。
2.Dcm 甲基化酶
Dcm 甲基化酶識別 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二個(gè)胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。受 Dcm 甲基化作用影響的酶有 EcoRⅡ(↓CCWGG)。大多數(shù)情況下，其同裂酶 BstNⅠ(CC↓WGG)可避免這一影響，因?yàn)槎咦R別序列雖然相同，但切點(diǎn)不同。
受此甲基化酶影響的酶還有 Acc65Ⅰ、 AlwNⅠ、 ApaⅠ、EcoRⅡ 和 EaeⅠ 等。不受此甲基化影響酶有 BanⅡ、 Bg1Ⅰ、 BstNⅠ、 KpnⅠ 和 NarⅠ 等。
3.EcoKⅠ 甲基化酶
EcoKⅠ 甲基化酶的識別位點(diǎn)少，識別 AAC(N)6GTGC 和 GCAC(N)6GTT 序列中 A 的 N6 位置。但因?yàn)樽R別位點(diǎn)少(1/8kb)，所以研究較少。
4.SssⅠ 甲基化酶
SssⅠ 甲基化酶來自原核生物 Spiroplasma ，可使 CG 序列中的 C 在 C5 位置上甲基化。甲基化的模板可以是甲基化或半甲基化鏈(新合成鏈)的 DNA 鏈。 SssⅠ 甲基化的 DNA 受 E.coli 中 mcrA、 mcrBC、 mrr 系統(tǒng)的限制。許多酶對此甲基化敏感，如 AatⅡ、 ClaⅠ、 XhoⅠ、 SalⅠ 等，也有不敏感的，如 BamHⅠ、 EcoRⅠ、 SphⅠ 和 KpnⅠ 。
二、依賴于甲基化的限制系統(tǒng)
E.coli 中至少有 3 種依賴于甲基化的限制系統(tǒng) mcrA、 mcrBC 和 mrr ，它們識別的序列各不相同，但只識別經(jīng)過甲基化的序列，都限制由 CpG 甲基化酶(M SssⅠ)作用的 DNA (限制即消化降解)。 Mrr 限制 m6A ; McrA 限制 HpaⅡ 甲基化修飾的位點(diǎn); McrBC 切割兩套半位點(diǎn)(G/A)mC ，這兩套位點(diǎn)之間間隔 2kb ，最適為 55～103bp ，需 GTP ;大多數(shù)常用的 E.coli 都含這三個(gè)限制系統(tǒng)中的一個(gè)或幾個(gè)，三個(gè)都不限制 Dcm 修飾的位點(diǎn)，Mrr不限制 dam、 EcoKⅠ、EcoRⅠ 修飾的位點(diǎn)。
三、甲基化對限制酶切的影響
1.修飾酶切位點(diǎn)
HincⅡ 可識別四個(gè)位點(diǎn)(GTCGAC、 GTCAAC、 GTTGAC 和 GTTAAC)，甲基化酶 M.TaqⅠ 可甲基化 TCGA 中的 A ，所以 M.TaqⅠ 處理 DNA 后， GTCGAC 將不受 HincⅡ 切割。
M.MspⅠ 修飾的產(chǎn)物為 m5CCGG ，在 BamHⅠ 識別位點(diǎn)(GGATCC)前面如果為 CC 或后面為 GG ，那么經(jīng) M.MspⅠ 處理的 DNA (GGAT m5CCGG)對 BamHⅠ 不敏感(即抵抗切割)。
構(gòu)建 DNA 文庫 時(shí)，用 AluⅠ(AG↓CT) 和 HaeⅢ(GG↓CC) 部分消化基因組 DNA 后，將得到的片段用 M.EcoRⅠ 甲基化酶處理，然后加上合成的 EcoRⅠ 接頭，再用 EcoRⅠ 來切割時(shí)只有接頭上的位點(diǎn)可被切割，從而保護(hù)基因組片段。
2.產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)
通過甲基化修飾可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)。 DpnⅠ 是依賴甲基化的限制酶， TCGATCGA 受 M.TaqⅠ 處理后形成甲基化(A)產(chǎn)物 TCG*ATCG*A ，其中 G*ATC 即為 DpnⅠ 位點(diǎn)。
3.對基因組作圖的影響
在研究哺乳動(dòng)物 m5CG 、植物 m5CG 和 m5CNG 、腸道細(xì)胞 Gm6ATC 的甲基化水平和分布時(shí)，利用限制酶對甲基化的敏感性差異，大有作為。
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