雙熒光素酶報告基因測試
在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達時 ，通常采用第二個報告基因來減少實驗的變化因素。但傳統的共報告基因（比如CAT，β-Gal，GUS）不夠便利。因為各自的測試化學，處理要求，檢測特點存在差異。
Promega提供一種先進的雙報告基因技術，結合了螢火蟲熒光素酶測試和海洋腔腸熒光素酶測試。雙熒光素酶報告基因測試系統，結合pRL載體系統，表達第二個報告基因海洋腔腸熒光素酶，在單管中進行雙熒光素酶報告基因測試，快速，靈敏，簡便。
系統還提供PLB裂解液，用來裂解在多孔板中培養的哺乳細胞，不需操作單個樣品。對于正在使用螢火蟲熒光素酶報告基因載體的研究人員。雙熒光素酶報告基因測試系統將使他們立即體會到該系統的便利。
介 紹
雙報告基因用于實驗系統中作相關的或成比例的檢測，通常一個報告基因作為內對照，使另一個報告基因的檢測均一化。檢測基因表達時雙報告基因通常用來瞬時轉染培養細胞，帶有實驗報告基因的載體共轉染帶有不同的報告基因作為對照的第二個載體。
通常實驗報告基因偶聯到調控的啟動子， 研究調控基因的結構和生理基礎。報告基因表達活力的相對改變與偶聯調控啟動子轉錄活力的改變相關，偶聯到組成型啟動子的第二個報告基因，提供轉錄活力的內對照， 使測試不被實驗條件變化所干擾。
通過這種方法，可減少內在的變化因素所削弱的實驗準確性，比如，培養細胞的數目和活力的差別，細胞轉染和裂解的效率。
使用螢火蟲熒光素酶，結合氯霉素乙酰轉移酶（CAT），β-半乳糖苷酶（β-Gal），或葡萄醛酸糖苷酶（GUS）的雙報告基因，近幾年已普遍使用。
但這些雙報告基因組合削弱了熒光 素酶操作的優勢 , 比如熒光素酶測試和定量可在幾秒鐘內進行， 但CAT，β-Gal和GUS測試法， 則在定量前需要長時間的保溫。另外，這些報告基因受限于它們的靈敏度和線性應答范圍， 必須注意不要超過這些范圍，內源性細胞活力也會干擾這類報告基因的使用。
許多類型的細胞有內源β-Gal或GUS表達，不利于準確定量報告基因表達， 胞內去乙酰酶活力干擾CAT活力測試。盡管在高溫下預處理細胞裂解液，會降低內源性β-Gal和CAT測試的干擾，但這些處理也會快速失活熒光素酶。因此，在此類雙報告基因檢測中， 必須以不同的步驟分別處理共轉染的細胞裂解液。
理想的雙報告基因方法應該使用戶能夠以螢火蟲熒光素酶所具有的速度，靈敏和線性范圍對同一樣品中的兩個報告基因同時測定。這在傳統的報告基因， 如CAT，β-Gal和GUS是不可能的，由于它們測試化學，處理要求所固有的局限。
相反，結合螢火蟲 （ Photinus pyralis ） 和海洋腔腸 （ Renilla reniformis ） 雙熒光素酶，Promega 的雙熒光素酶報告基因測試 （DLR） 系統可滿足這些要求，在單管中完成這些測試。
雙熒光素酶報告基因測試化學
熒火蟲和海洋腔腸熒光素酶都具有生物發光報告基因的卓越的測試特點，但它們在進化上的起源不同，因此，具有不同的酶學結構和底物要求。這些差別用來發展了DLR 測試化學，選擇性地區別這兩種發光報告基因的活力。
螢火蟲熒光素酶是一個61kDa單亞基蛋白質，酶活力不需翻譯后修飾，在翻譯后即可作為遺傳報告基因。在ATP，Mg2+ 和 O2存在下，通過甲蟲熒光素的氧化反應發光（圖1）。
在常規反應條件下，熒光素的氧化發生時，以熒光素-AMP作為中間體，轉換非常緩慢。結果，在底物和酶混合后，測試化學產生“閃爍”的光，并迅速衰減。專利化的測試試劑，定量螢火蟲熒光素酶活力，摻入了輔酶A（CoA）， 增強快速酶轉換來提高反應動力學， 導致持續的“閃爍”發光信號 （圖2） 。
圖1 由螢火蟲和Renilla熒光素酶催化的生物發光
海洋腔腸熒光素酶，一個36kDa單亞基蛋白質，純化自天然來源的Renilla reniformis，含有3%的碳水化合物，但是和螢火蟲熒光素酶一樣，酶活力不需翻譯后修飾，在翻譯后即可作為遺傳報告基因。
海洋腔腸熒光素酶所催化的發光反應，利用O2和海樣腔腸熒光素（coelenterazine）（圖1）。當用DLR測試化學作實驗時，海洋腔腸熒光素酶反應的動力學產生閃爍型發光信號，在檢測過程中緩慢地衰減（圖2）。
在DLR測試系統中，用單個裂解液分步測定螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶活力。在完成螢火蟲熒光素酶活力（“實驗”報告基因）的測定后，螢火蟲發光被快速湮滅，并同時激活海洋腔腸熒光素酶的發光反應（“對照” 報告基因）。
因此，DLR測試系統整合了兩個測試化學，對共表達的兩個報告基因作快速地定量，酶來自轉染細胞裂解液，或無細胞轉錄翻譯反應。
螢火蟲熒光素酶測試的線性范圍延伸達酶濃度的8個數量級，可測定≤1fg （大約10 -20 摩爾）的實驗報告基因酶（圖3A）。用雙熒光素酶報告基因測試系統，海洋腔腸熒光素酶的線性范圍達酶濃度的7個數量級，較低的底限是≤10fg （大約3×10 -19 摩爾）的對照報告基因酶（圖3B），并且這兩個酶的特異活力相似。
圖2 用雙熒光素酶報告基因測試由螢火蟲和Renilla熒光素酶產生的發光。CHO細胞（1×106 /60mm培養板）共轉染pGL3
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