蛋白酶切的基礎(chǔ)問(wèn)題
問(wèn)：我在蛋白方面比較菜，我有個(gè)蛋白需要做酶切，蛋白表達(dá)主要是以包涵體為主，溶解在8mol/l 尿素，或者1%SDS中，蛋白已經(jīng)變性了，請(qǐng)問(wèn)蛋白酶切是否能在變性的條件下酶切，還是一定要等到蛋白復(fù)性以后才能酶切? 還請(qǐng)指點(diǎn)一二。能否這樣做，就是把變性的蛋白通過(guò)透析成酶切的緩沖液體系，然后再酶切，這樣那些變性的尿素和SDS都去除，不知道這樣操作符不符合理論？
答：既然你的蛋白是包涵體，為什么不直接連接到pet21或者pet24中，這樣蛋白表達(dá)出來(lái)之后就是沒(méi)有tag，就少了酶切這一步了，不是嗎？
問(wèn)：是這樣，我的課題是接著我上屆的師兄做的，有個(gè)3C蛋白酶切位點(diǎn)，表達(dá)的是膜蛋白，純化后需要酶切下來(lái)才行，但是我一直都沒(méi)有搞清一個(gè)概念，尿素等溶解蛋白是是變性劑，比如TRITON0100那些非離子去污劑溶解蛋白是非變性條件，兩者對(duì)蛋白來(lái)說(shuō)有什么區(qū)別和不同呢，好象膜蛋白一般都是用TRITON-100來(lái)溶的，我表達(dá)餓這個(gè)膜蛋白不溶于TRIOTON ，而容于SDS或者尿素，我純化后該如何處理才能酶切呢？還請(qǐng)賜教。
答：是這樣，尿素和鹽酸胍是讓蛋白變性的，如果復(fù)性要去掉他們。triton x100或者sds之類(lèi)的去垢劑是為了不溶于水的蛋白，例如你的膜蛋白，溶于水中的。
你可以查找一些關(guān)于膜蛋白復(fù)性的文章看看。
去垢劑，如果很強(qiáng)也可以讓蛋白變性，只是和尿素不是一樣的機(jī)理。
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