氨基酸的紙層析的原理和操作方法
一、目的和要求
1.學習分配層析的原理和方法。
2.掌握氨基酸紙上層析法的操作技術（包括點樣、平衡、展層、顯色、鑒定）。
二、原理
層析法又稱色層分離法、色譜法。是一種分離分析多組分混合物質的極有效的物理及物理化學分析方法。
色譜法是目前各種化學分離法中最重要的一種方法。由于其分離效能高、分離速度快，試樣用量少等特點，已經成為在與化學有關的一切領域中廣泛應用的一種分離技術
紙層析是以濾紙為載體（惰性支持物）的分配層析。
什么是分配呢？
一般把物質在兩種互不相溶的溶劑之間的溶解過程稱為分配。達到平衡時，兩種溶劑中所溶解的溶質的濃度之比稱為分配系數，又稱平衡常數。
一個物質在某溶劑系統中的分配系數，在一定溫度下是一個常數。
濾紙纖維與水有較強的親和力，濾紙纖維能吸附25-29%的水分，其中6-7%的水以氫鍵與纖維素的羥基結合，在通常條件下較穩定，不易除去。這種水分組成為固定相。而有機溶劑與濾紙的親和力甚弱，因而有機溶劑為流動相（在纖維間空隙中流動），它沿著濾紙移動。溶劑由下向上移動的，稱上行法；由上向下移動，稱下行法。
將樣品在濾紙上（此點稱為原點）進行展層，樣品中的各種溶質（如各種氨基酸）即在兩相溶劑中不斷進行分配。由于它們的分配系數不同，不同溶質隨流動相移動的速率不等，于是就將這些溶質分離開來，形成距原點不等的層析點。
溶質在濾紙上移動的速率用Rf值表示：
原點到層析點中心的距離
Rf= ————————————
原點到溶劑前沿的距離
只要條件（如溫度、展層溶劑的組成、濾紙的質量等）不變，Rf值是常數。故可根據Rf值作定性分析。
三、 試劑與器材
（一） 試劑
1、酸性展開劑：4份水飽和的正丁醇和1份醋酸的混合物。將20毫升正丁醇和5毫升醋酸放入分液漏斗中，與15毫升水混合，充分震蕩，靜止后分層，放出下層水層。取擴展劑倒入培養皿中備用。
2、顯色劑：0.1%茚三酮顯色液：稱取0.1g茚三酮，溶于100ml正丁醇中。
3、未知氨基酸溶液
4、標準氨基酸溶液。
（二）器材
1、毛細管。
2、標本缸。
3、新華濾紙一號。（如果濾紙不干凈，可用0.4mol/LHCL浸包20小時或過夜后，用 蒸餾 水洗至中性，再用95%乙醇沖洗，晾干后用。）
4、噴霧器。
5、培養皿。
6、分液漏斗。
7、電吹風。
四、操作
1、層析濾紙的準備
在15cm×20cm的濾紙上一端距邊緣3cm處用鉛筆輕輕劃一條直線，在此直線上每間隔3cm做一記號。
2、點樣：用毛細管將各 氨基酸 樣品分別點在這四個位置上；每點完一次后，吹干再點第二次。點的直徑應小于0.5cm，每點共點三到四次。
3、平衡與展開
將濾紙縫成圓筒形（注意紙的二邊不相碰），掛在層析缸蓋內的鉤上，蓋好蓋子飽和20～30min。然后將濾紙筒放入盛有展開劑的培養皿中（點樣的一端在下，展開劑的液面需低于點樣線1cm），待溶劑前沿上升到離頂端1cm時取出，吹干至無正丁醇氣味為止,用鉛筆畫出溶劑前沿界線。
4、顯色：用0.1%茚三酮溶液均勻噴霧顯色，65℃烘干或吹干即可顯出各種 氨基酸 的層析斑點。
五、定性鑒定
計算各種氨基酸的R f 值，與各種氨基酸的標準Rf值（25±1℃）見主要參考書1的p49表2-4）對照鑒定是什么氨基酸。
六、注意事項
1、 濾紙 要保持清潔，操作時勿用手接觸，載手套或只拿邊角。
點樣斑點要盡量小，最大不超過0.5cm的直徑，每次點樣后用冷風吹干再點第二次。
2、展開時點樣點不要浸入有機溶劑中，至少要平衡半小時或1~2小時。
3、顯色時噴霧要均勻小點，不均勻會將斑點（溶質）沖下來。
4、溶劑必須新鮮配制并搖勻才能使用。
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