米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速度（Vm）的測定

酸性磷酸酯酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)分析

米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速度（Vm）的測定

原理

在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的速度有很大的影響。在底物濃度很低時(shí)，酶促反應(yīng)的速度（v）隨底物濃度的增加而迅速增加；隨著底物濃度的繼續(xù)增加，反應(yīng)速度的增加開始減慢；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥侥撤N程度時(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到一個(gè)極限值（Vmax）。

底物濃度與反應(yīng)速度的這種關(guān)系可用Michaelis-Menten方程式表示：

式中

v——反應(yīng)速度；

Km——米氏常數(shù)；

Vmax——酶反應(yīng)最大速度；

[S] ——底物濃度。

從米氏方程式可見：米氏常數(shù)Km等于反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，米氏常數(shù)的單位就是濃度單位(mol/L或mmol/L)。

在酶學(xué)分析中，Km是酶的一個(gè)基本特征常數(shù)，它包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)。Km與底物濃度、酶濃度無關(guān)，與pH、溫度、離子強(qiáng)度等因素有關(guān)。對(duì)于每一個(gè)酶促反應(yīng)，在一定條件下都有其特定的Km值，因此可用于鑒別酶。

測定Km、Vmax，一般用作圖法求得。作圖法有很多，最常用的是Linewaver-Burk作圖法，該法是根據(jù)米氏方程的倒數(shù)形式，以1/v對(duì)1/[S]作圖，可得到一條直線。直線在橫軸上的截距為 -1/Km，縱截距為1/Vmax，可求出Km與Vmax。

方法和步驟

1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

取9支試管，按0～8編號(hào)。

1～8號(hào)管分別加入0.1至0.8mL酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，并用蒸餾水將各管體積補(bǔ)充至1.0mL，0號(hào)管中加入1.0mL蒸餾水。

各管各加1mol/L碳酸鈉溶液2.0mL和Folin-酚稀溶液0.5mL，搖勻后，35℃保溫顯色10分鐘。

以0號(hào)管作空白，在可見光分光光度計(jì)680nm波長處讀取各管的吸光度A 680 。

整個(gè)操作過程見下表：

管號(hào)	1	2	3	4	5	6	7	8	0
酚含量/μmol	0.04	0.08	0.12	0.16	0.20	0.24	0.28	0.32	-
0.4mmol/L酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液/mL	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7	0.8	-
蒸餾水/ mL	0.9	0.8	0.7	0.6	0.5	0.4	0.3	0.2	1.0
1mol/L碳酸鈉溶液/ mL	2	2	2	2	2	2	2	2	2
Folin-酚稀溶液/mL	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5

以酚含量(μmol)為橫座標(biāo)，以A 680 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、測定Km、Vmax

取試管 7支，按照0～6編號(hào)，空白管為0號(hào)。

各管按下表加入不同體積5mmol/L磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)，并分別補(bǔ)充0.2mol/L pH5.6乙酸鹽緩沖液至0.5mL。

35℃預(yù)熱2min后，逐管記時(shí)加入酸性磷酸酯酶酶液0.5mL，搖勻，精確反應(yīng)15min。

各管反應(yīng)時(shí)間到達(dá)后立即加入1mol/L碳酸鈉溶液2mL，搖勻，再加入Folin-酚稀溶掖0.5 mL，35℃保溫顯色l 0min。

0號(hào)管內(nèi)最后加入0.5 mL酶液，其它操作與上述各管相同。

冷卻后以0號(hào)管作空白，在可見光型分光光度計(jì) 680nm波長處讀取各管的吸光度A 680 。

在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的速度有很大的影響。

在底物濃度很低時(shí)，酶促反應(yīng)的速度（v）隨底物濃度的增加而迅速增加；隨著底物濃度的繼續(xù)增加，反應(yīng)速度的增加開始減慢；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥侥撤N程度時(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到一個(gè)極限值（Vmax）。

管號(hào)	1	2	3	4	5	6	0
磷酸苯二鈉終濃度/ mmol×L -1	0.5	0.75	1.0	1.25	1.50	2.50
5 mmol/L磷酸苯二鈉/ mL	0.10	0.15	0.20	0.25	0.30	0.50	0.5
0.2mmol/L乙酸鹽緩沖液 / mL	0.4	0.35	0.30	0.25	0.20	0	0
稀釋酶液/ mL	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5 (最后加入)
1mol/L碳酸鈉溶液/ mL	2	2	2	2	2	2	2
Folin-酚稀溶液/mL	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
A 680