文獻解讀 | 糖尿病患者福音！認知損傷有救了！間歇性禁食改善糖尿病引起的認知損傷
導讀：
認知減退是2型糖尿病中一種嚴重的并發癥，其中的病因是多因素的。
研究人員發現28天間歇性禁食方式能夠通過微生物菌群-代謝物-腦軸改善行為障礙：
間歇性禁食能夠提高海馬線粒體的生物合成和能量代謝基因表達；重構腸道微生物；同時改善與認知功能相關的微生物代謝物。
而且研究人員還發現了間歇性禁食影響的基因、微生物和代謝物之間的緊密聯系。
這篇文章我們就來詳細看一下間歇性禁食如何改善認知損傷。
研究背景：在世界范圍內的2型糖尿病 (T2D) 患病數量越來越多。
而認知減退是2型糖尿病中一種嚴重的并發癥，其中的病因是由多因素引起的。
包括大腦胰島素抵抗、大腦微血管損傷和神經炎癥。
以前的研究發現T2D相關的或高脂引起的認知缺陷與大腦胰島素抵抗、葡萄糖攝取下降、神經遞質代謝失調和線粒體功能紊亂有關。
間歇性禁食（IF）是一種周期性的禁食方法，可有效改善代謝，減輕胰島素抵抗等T2D癥狀，在一些動物模型中也顯示出神經保護和改善認知的作用，但其對T2D引起的認知功能障礙的保護作用尚不清楚。
在這里，研究人員發現28天IF方式能夠通過微生物菌群-代謝物-腦軸改善行為障礙：IF能夠提高海馬線粒體的生物合成和能量代謝基因表達；重構腸道微生物；同時改善與認知功能相關的微生物代謝物。
而且研究人員還發現了IF影響的基因、微生物和代謝物之間的緊密聯系。
用抗體清除腸道微生物能夠部分廢止IF的神經保護作用。在提升認知功能方面，IPA、5-HT、SCFAs和TUDCA具有和IF飲食相似的效果。
實驗設計：
主要結論：
1. IF抑制胰島素抵抗和認知障礙將自發2型糖尿病的db/db小鼠分為2組，分別進行隨意飲食（以下簡稱AL）或者間歇性禁食（以下簡稱IF），歷時28天。
以正常db/m小鼠AL飲食作為正常對照。結果發現，IF在不改變全部能量攝取的情況下減輕了db/db小鼠的體重。此外，在此療法結束時，IF處理大大地減少了db/db小鼠每天的攝水量和尿量。
在第28天，通過胰島素耐受試驗評估IF在db/db小鼠中對胰島素抵抗的影響，與AL飲食的小鼠相比，IF處理通過抑制空腹血糖水平（降低54.8％）和空腹胰島素水平（降低29.8％）來提高db/db小鼠的胰島素敏感性。
db/db小鼠經IF治療后，反映胰島素抵抗的HOMA-IR值降低。此外，IF有意地減少了附睪白色脂肪組織（eWAT）的質量和脂肪細胞的大小。
Morris水迷宮測試顯示IF處理可改善糖尿病小鼠的認知能力、增加空間記憶。高架迷宮的結果表明，IF療法可改善db/db小鼠的焦慮行為和自主活動能力。
2. IF改善突觸超微結構和胰島素信號傳導處死小鼠后，觀察了參與認知和記憶的腦區海馬突觸的超微結構。
突觸后密度（PSD）分析顯示，與db/db組相比，db/db-IF組小鼠PSD的長度和寬度均升高。在海馬區對胰島素信號進行評估，結果顯示IF增加了IRS1-Tyr896/IRS1和Akt的磷酸化，表明它激活了海馬胰島素信號通路。
另外還觀察到，與db/db小鼠相比，IF治療增強了BDNF（一種參與維持神經元存活和突觸功能的神經營養因子）的表達，并增強ERK/CREB的磷酸化（BDNF合成的上游信號）。
同樣地，在IF處理的小鼠的海馬區中，興奮性突觸后密集區中的一種支架蛋白PSD-95的表達也增加了，這與PSD超微結構的改變一致。
還值得注意的是，介導炎癥的主要轉錄因子NFκB在糖尿病小鼠的海馬中被激活，而IF處理抑制了NFκB的活化，并下調了JNK/p38的磷酸化和Iba-1的蛋白表達。
3. IF促進海馬的線粒體生物發生為了確定海馬區中IF調控的關鍵生物學過程和途徑，對小鼠海馬區進行了RNA測序，與db/db和db/m小鼠相比，發現db/db-IF小鼠中有1181個基因高表達，其中大多數富含線粒體相關的GO條目。
對db/db小鼠中低表達基因的GO條目分析表明，db/db小鼠的呼吸鏈和線粒體分裂/翻譯生物學過程是失調的，提示糖尿病小鼠海馬線粒體代謝異常。
然而與線粒體相關基因表達有關的調控通過IF療法得到了糾正。
此外，經IF處理后，db/db小鼠海馬區中483個基因的表達與db/m小鼠中的水平相當，甚至其中31.3％的基因比db/m小鼠中的表達量更高（60個基因）或更低（91個基因）。IF還通過上調線粒體基因表達來提高與KEGG氧化磷酸化（OXPHOS）途徑相關的基因。
對這些基因的KEGG分析還表明，IF處理改善了在db/db小鼠中下調的OXPHOS中能量代謝相關基因的表達。
加權基因共表達網絡分析（WGCNA）確定了5個包含功能和生物連鎖基因的模塊。
qPCR分析證實，在db/db小鼠中，IF上調了線粒體和代謝基因的表達。
作為線粒體生物發生指標，db/db小鼠海馬中的mtDNA/nDNA比值被IF升高，表明線粒體基因上調可能是線粒體質量增加的結果。
進一步通過檢測PGC1α和AMPK/mTOR蛋白的表達，以揭示db/db-IF組中線粒體生物發生上調的潛在機制。
IF導致線粒體生物發生的主要調節子PGC1α蛋白表達的顯著增加；這與線粒體相關基因的上調建立了強烈的相關性。
與先前的研究一致，IF增加了AMPK的活性，該激酶對禁食狀態下細胞能量代謝敏感，并抑制了mTOR的磷酸化，mTOR是一種真核細胞營養傳感器，在調節線粒體質量控制和OXPHOS過程中起著至關重要的作用。
4. IF重塑了腸道菌群和菌群代謝物腸屏障的完整性對于維持腸通透性和預防內毒素血癥至關重要，并且還與糖尿病及其并發癥相關。
也有報道說，腸道通透性增加會增加內毒素血癥，從而加劇炎癥，進而觸發葡萄糖耐量受損。
因此，通過評估絨毛長度、肌層厚度和杯狀細胞數量來研究IF對腸屏障完整性的影響。
結果顯示，IF增加了糖尿病小鼠的絨毛長度和肌層厚度，但對杯狀細胞的數量沒有影響。
結腸通透性的結果提示IF可阻止腸漏并伴隨血漿LPS水平的下降。
腸屏障中的緊密連接蛋白claudin-1的表達在db/db-IF結腸組織中也有所升高，這與腸道通透性的改變相一致。
在第0天（基線水平）和第28天，使用16S rRNA測序檢測小鼠糞便樣本中的腸道菌群組成。
結果發現，雖然OTUs的總數仍然保持在最初的相同水平上，但α多樣性在經過28天的IF處理后顯著增加
。db/db-IF小鼠在第28天的未加權Unifrac距離與其他組不同，這表明IF療法同時改變了β多樣性。
考慮到時間作為一個影響背景，不同的飲食和鼠的基因型是腸道微生物組塑形的主要因素，分別解釋了總變異的5.9％和7.7％。
IF處理并不能完全抵消糖尿病的影響，Allobaculum和Bifidobacterium的相對豐度在db/db小鼠中均減少。
然而，IF處理改善了Lactobacillus和丙*酸鹽產生菌Odoribacter的豐度，同時Enterococcus、Streptococcus和 unknown Enterococcaceae是減少的。與db/db組相比，在db/m和db/db-IF組中，來自Candidatus Arthromitus、Rummeliibacillus、unknown Enterococcaceae和Leuconostocaceae的細菌均較低。
此外，已鑒定的IF相關屬與肥胖、認知相關的血糖和體重有關。
具體而言，Candidatus Arthromitus和unknown Leucostocaceae與血糖呈正相關（Pearson相關系數分別為0.52和0.72，p<0.05）。
unknown Enterococcaceae與體重呈正相關（Pearson相關系數=0.59，p<0.05）。
考慮到小鼠基因類型的影響，在第28天評估了db/db組和db/db-IF組小鼠的腸道菌群組成。
發現總共有17個受IF影響的zOTUs，其中5個屬于Lactobacillus。
同時，PICRUSt分析揭示了11種不同豐富的KEGG基因通路。
其中，在db/db-IF組中初級和次級膽汁酸的生物合成豐富。
為了研究IF治療對腸道菌群和宿主代謝的影響，研究人員利用非靶向代謝物組學進行檢測分析，發現IF處理28天后，db/db小鼠血漿中許多代謝物發生了明顯變化。
特別強調了預先確定的、其水平主要由腸道菌群的豐富度來調節的23種微生物代謝產物的子集，以證明IF處理、腸道菌群和代謝組之間的直接聯系。
在這些代謝產物中，與AL組的的db/db小鼠相比，IF組血漿中5-HT、色氨酸、對羥基苯*乙*酸、N-乙酰基色氨酸、肉桂酰甘氨酸、IPA和膽汁酸（如膽酸（CA）、脫氧膽酸（DCA）、鼠李酸（MCA）和TUDCA）的水平升高。相反，db/db-IF組的酪氨酸、苯基乙酰基甘氨酸、苯基丙酰甘氨酸、磷酸甲*酚和對*甲*酚硫*酸鹽以及12-羥基二十碳五烯酸（12-HEPE）的水平低于db/db組。
短鏈脂肪酸（SCFA）被證明具有保護腸屏障功能和調節胰島素敏感性的功能，因此，研究人員還分析了糞便樣品中SCFA的濃度。經過28天的處理，IF改善了db/db小鼠的乙酸鹽、丙*酸鹽和丁*酸鹽水平。而血漿中的SCFA濃度很低，因此在本研究中使用非靶向的代謝組學無法準確檢測到。
5. IF療法的綜合多組學分析在確定了IF在糖尿病小鼠中上調或下調的不同組學特征后，下一步是評估海馬區基因表達、腸道菌群組成和微生物代謝產物之間的相互作用，與IF處理對小鼠認知缺陷觀察到的影響相聯系。
利用DIABLO法對多組學數據進行分析，該方法是一種多元降維判別分析的方法，旨在從各種組學技術中識別出生物學相關和高度相關的特征。在進行多組學整合之前，首先評估了IF上調的樞紐（hub）基因（n=36）、IF改變的OTUs（n=17），預先確定的血漿微生物代謝產物（n=23）和三個糞便SCFAs，即乙酸鹽、丁*酸鹽和丙*酸鹽，是否能夠以多變量方式預測小鼠的IF狀態。
使用部分最小二乘鑒別分析進行預測建模，并將其納入重復雙交叉驗證框架（rdCV-PLSDA），從而有效地降低了統計的擬合風險。
在db/db和db/db IF小鼠之間實現了顯著分離，hub基因、OTUs和代謝物的預測準確度分別為100%、90%和95%。
對于每個組學數據集，潛在成分的最佳選擇數為1。
所構建模型的預測能力優于1000個置換模型，證明了預測模型在區分db/db和db/db-IF時的穩健性和有效性，該模型使用了組學特征的簡約集，具有很強的通用性。
然后對多組學特征進行綜合建模，并從每個組學數據集中確定了一個潛在成分，包括10個關鍵預測因子，在db/db和db/db-IF之間形成了很大的分離。
最佳選擇的關鍵預測因子包括幾種腸道菌群，即Lactobacillus、Bacteroides和 Facklamia, 微生物共代謝物，如膽汁酸、IPA、5-HT、色氨酸、羥基色酚和硫酸吲哚酚，以及富含線粒體、核糖體或代謝相關GO術語的基因。關鍵預測因子也是高度相關的。
6. IF的有益作用需要腸道菌群為了證明腸道菌群在介導固有糖尿病認知缺陷中的關鍵作用，研究人員嘗試研究去除db/db小鼠腸道菌群后，IF所觀察到的有益作用是否會受到影響。
應用抗生素雞尾酒療法來確定微生物群在IF提供的神經保護中的作用。
在4周IF處理開始前14天以及整個實驗過程中，給小鼠飲用水中添加抗生素，28天后評估其行為學變化。
抗生素治療削弱了IF治療的減肥效果。
抗生素治療對eWAT的重量沒有影響，但會增加肝臟和盲腸的重量。
IF和抗生素處理均能減少db/db小鼠的食物和攝水量。然而，抗生素的使用并沒有影響IF對胰島素抵抗的有益作用。
值得注意的是，使用Morris水迷宮測試評估的認知改善與IF相關，部分被抗生素治療所消除。
此外，在db/db-IF小鼠中抗生素處理廢除了線粒體生物發生的上調。對PSD的分析顯示，通過抗生素處理，db/db-IF小鼠的PSD寬度減小了。
這些結果共同表明，腸道菌群的移除部分地消除了IF對認知功能的保護作用。
另外，與db/db-IF組相比，通過抗生素處理移除腸道菌群，可顯著降低db/db小鼠血漿中IPA的水平和糞便中SCFAs水平。
7. 腸道菌群代謝物改善認知功能另外進行的一項動物實驗，以研究IF在調節腸道菌群代謝產物，特別是在抗生素治療組中降低的IPA和SCFAs在改善認知缺陷中的作用。
除此之外，還研究了外周5-HT和TUDCA對認知功能的影響，因為在這項研究中顯示IF組中這些代謝產物是升高的。
先前的研究也報道了其神經保護作用的潛力。
在db/db小鼠中，所有這些代謝物分別地口服均可改善認知功能和胰島素敏感性。
與IF處理的有益效果相一致，這些代謝物的口服還增強了線粒體的生物發生并保護了突觸的超微結構。
此外，TUDCA的處理可抑制db/db小鼠的體重增加，而其他測試的代謝物則不能。
此外，所有代謝物處理對db/db小鼠的攝食量和攝水量都沒有影響。
雖然這些代謝物的處理劑量高于IF療法組小鼠，但這些結果部分地評估了這些代謝物在IF療法中的因果關系和作用。
總結：大量研究表明，IF通過重塑腸道菌群對糖尿病及其并發癥發揮有益作用。
但是，IF是否可以緩解糖尿病相關的認知缺陷以及在腸道菌群中所起的作用仍不清楚，這就迫切需要對IF是如何改善認知功能的潛在機制作研究。
本研究通過對糖尿病小鼠行為/突觸結構、線粒體/能量代謝相關信號的全面研究，以及對多組學的整合分析，首次證明了28天的IF處理可通過微生物-代謝物-腦軸減輕糖尿病誘發的認知障礙。
總體而言，當前的研究表明，在IF治療后的糖尿病小鼠中，腸道菌群可通過腸道菌群代謝產物與認知功能之間建立新穎而令人信服的聯系。
IF治療可重塑腸道菌群并改變腸道菌群代謝產物，上調海馬區線粒體的生物發生和能量代謝，保護突觸超微結構，并減輕認知和空間記憶障礙。
IF對菌群/代謝物/基因變化的影響應該在臨床試驗中進一步評估。
一旦通過驗證，IF便可作為用于控制代謝性和神經退行性疾病的新型生態方法。
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