人血清抗胰蛋白酶（α1－AT）的分離純化及鑒定
【目的要求】
1. 掌握α1-AT分離純化各步驟原理、操作及鑒定方法
2. 掌握基本技術操作及儀器使用
3. 熟悉人血清蛋白質的分類方法,α1-AT性質
4. 了解生物大分子 制備技術, 分離純化類型
5. 學會利用學過的分離純化方法進行基本的科研設計 6.練習研究論文基本寫作
【教學內容一】
分段鹽析法，凝膠過濾法(鹽析法概念及原理，分段鹽析概念，分子篩效應，柱層析 基本技術)
【實驗原理】
1. 鹽析法是一種利用蛋白質在高鹽溶液中溶解度不同而分離的方法。通過將硫酸銨加入蛋白質溶液中，使蛋白質表面電荷被中和，水化膜被破壞，導致蛋白質在水溶液中的穩定性因素去除而沉淀。
2. 通過分段改變鹽類濃度達到分離目的的方法叫分段鹽析法。
3. 凝膠過濾又稱分子篩層析。混合物隨流動相流經裝有凝膠作為固定相的層析柱 時，分子量大的物質因不能進入凝膠網孔而沿凝膠顆粒間的空隙先被洗脫(阻力小,流程短,流速大),分子量小的物質因能進入凝膠網孔而受阻滯,流速緩慢,流程長而后被洗脫,由于流速不同可以把大小不同的分子分開.
【儀器與試劑】
1.離心機
2.真空泵
3.飽和硫酸銨溶液：稱取767g固體硫酸銨，加入1000ml水中，加熱使之溶解，室溫冷卻后4℃靜置過夜，然后用氨水將pH調至中性。
4.固體(NH4)2SO45.Sephadex G—256.奈氏試劑7. 雙縮脲試劑8.pH7.4, 0.05M PBS
【步驟】
一 分段鹽析
1.觀看人血清抗胰蛋白酶(α1-AT)的分離及鑒定教學錄像2.每組量取20ml血清，倒入一干凈燒杯中，緩慢加入飽和硫酸銨20ml，邊加邊攪拌,放入4℃冰箱30分鐘3.從冰箱中取出燒杯，將血清倒入離心管，3000rpm。
離心20分鐘4.將上清倒入一干凈量筒中，記錄體積后，倒入干凈燒杯中，按17.6g/100ml量取固體硫酸銨，緩慢加入上清中，邊加邊攪拌。4℃冰箱放置30分鐘5.將燒杯中液體倒入抽濾器 中，負壓抽濾6.刮下濾紙上的粗提蛋白，用4ml緩沖液溶解，準備加樣
二 凝膠過濾層析
1.凝膠柱準備：(1)連接層析柱(2)夾住出口，加入1/3體積的0.05M pH6.4 PBS，灌膠，待凝膠自然沉降約1cm時，打開出口，控制流速，60滴/分(3)層析柱填裝完成后，連接下口瓶，調節流速，使入口和出口流速相同。
平衡至入口pH值與出口pH值相同(即pH試紙呈色相同)，關閉出口，等待加樣2.加樣：用吸管吸去膠面以上的緩沖液，立即加入蛋白粗提液(沿管壁緩慢加入)3.打開出口，調流速15滴/分，待蛋白粗提液完全進入膠面，用少量緩沖液清洗管壁。
連接下口瓶4.檢測：用雙縮脲試劑檢測洗脫液。待試劑變紅，開始收集，直到試劑不變色停止收集。測量并記錄收集液的體積，留取1ml樣品(標記為G—25樣品)，放入一冷凍管中冰箱凍存;剩余的液體收集入一大試管中，作好標記，下次實驗用5.洗去銨鹽：全速洗脫，用奈氏試劑檢測洗脫液，直到橙色消失為止，回收凝膠
【注意事項】
1.鹽析所用器皿一定要干燥
2.鹽析時，應將飽和硫酸銨或固體硫酸銨加入到血清中，且邊加邊攪拌
3.層析柱上方要留有少量液體，避免使凝膠暴露于空氣中
4.凝膠過濾上樣時，使樣品沿管壁緩緩流下，勿沖破膠面
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