貼壁細胞的凍存

貼壁細胞凍存實驗準備：
將15mL離心管、凍存管、PBS緩沖液、移液管、電動移液器等物品提前放入生物安全柜中，紫外照射30min消毒滅菌；
細胞完全培養(yǎng)基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、細胞凍存液等從4℃冰箱中取出后，復溫至室溫，備用；程序降溫盒復溫至室溫備用。

貼壁細胞凍存操作步驟：
1. 從培養(yǎng)箱中取出準備凍存的細胞；
2. 顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)并拍照記錄；
3. 酒精消毒培養(yǎng)瓶后放入安全柜中；
4. 吸去多余的培養(yǎng)基，加人2~3ml PBS緩沖液潤洗一次；
5. 加入1ml胰酶，放入37℃消化；
6. 消化1min左右，在顯微鏡下觀察細胞消化情況；
7. 消化完全后，加3ml完全培養(yǎng)基終止；
8. 將細胞懸液移入15ml離心管中離心，1000rpm/min（約200g）離心3-5min；
9. 吸去多余的液體，向細胞沉淀中加入適量的凍存液，輕輕吸打混勻；
10. 按比例分裝至凍存管中；
11. 貼好標簽后放入梯度凍存盒中；
12. 將凍存盒放入-80℃，降溫過夜后，移入液氮中保存。

注意事項：
1）細胞凍存液需提前配制，不可直接將DMSO加入細胞懸液中；
2）不同細胞消化時間有差異，以實際鏡檢結(jié)果為準，大部分細胞回縮變圓并有少量細胞脫落即可中止消化，消化時間不宜過長；
3）應選擇匯合度80%-90%左右，細胞處于對數(shù)生長期時進行凍存操作，確保細胞凍存時狀態(tài)最佳，凍存密度可根據(jù)細胞特性進行調(diào)整；
4）凍存細胞保存溫度應低于-130℃，不可在-80℃長期保存。