利用熒光分光光度法定量維生素B2的操作小技巧
維生素B12在一定波長的光照射下，會發(fā)出綠色熒光，制作多維葡萄糖粉試樣的標準曲線，根據(jù)熒光強度可以計算多維葡萄糖粉中維生素B12的含量。
實驗?zāi)康?/span>
?學習熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的分析原理。
?掌握熒光分光光度計 的操作技術(shù)和測定多維葡萄糖粉中維生素B2 的方法。
熒光分析法實驗原理
常溫下，處于基態(tài)的分子 吸收一定的紫外可見光的輻射能成為激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子通過無輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級，再以輻射躍遷的形式回到基態(tài)，發(fā)出比吸收光波長長的光而產(chǎn)生熒光。
在稀溶液中，熒光強度IF與物質(zhì)的濃度c有以下的關(guān)系：
當實驗條件一定時，熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系：
這是熒光光譜法定量分析的理論依據(jù)。
熒光分析法的特點
a. 與紫外-可見分光度法比較，熒光分析法具有更高的靈敏度。
b. 選擇性好。熒光法既能依據(jù)發(fā)射光譜，又能依據(jù)吸收光譜來鑒定物質(zhì)。
970CRT熒光光度計(上海分析儀器總廠)
5 mL吸量管1只，2 mL吸量管1只， 50 mL容量瓶7只
10.0μg·mL-1VB2標準溶液(置陰暗處保存)，冰乙酸(AR)，
多維葡萄糖粉試樣
c. 所需試樣量少、操作方法簡便。
熒光光譜
激發(fā)光譜
激發(fā)光譜：固定測量波長(選最大發(fā)射波長)，化合物發(fā)射的熒光強度與照射光波長的關(guān)系曲線。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大。
發(fā)射光譜
發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長), 化合物發(fā)射的熒光強度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。
固定發(fā)射光波長進行激發(fā)光波長掃描，找出最大激發(fā)光波長，然后固定激發(fā)光波長進行熒光發(fā)射波長掃描，找出最大熒光發(fā)射波長。激發(fā)光波長和發(fā)射熒光波長的選擇是本實驗的關(guān)鍵。
多維葡萄糖粉中維生素B2含量的測定
維生素B2(又叫核黃素，VB2)是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶，其結(jié)構(gòu)式為：
維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對熱穩(wěn)定。
維生素B2溶液在430～440 nm藍光的照射下，發(fā)出綠色熒光，其峰值波長為525 nm。VB2的熒光在pH=6～7時最強，在pH=11時消失。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強的多，故測VB2的熒光時溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進行。
多維葡萄糖中含有維生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中維生素C和葡萄糖在水溶液中不發(fā)熒光，維生素B1本身無熒光，在堿性溶液中用鐵氰化鉀氧化后才產(chǎn)生熒光，維生素D2用二氯乙酸處理后才有熒光，他們都不干擾維生素B2的測定。
實驗預(yù)習
v預(yù)習熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的分析原理。
v了解熒光光度計的操作步驟和測定多維葡萄糖粉中維生素B2 的方法。
儀器與試劑
970CRT熒光光度計(上海分析儀器總廠)
5 mL吸量管1只，2 mL吸量管1只， 50 mL容量瓶7只
10.0μg·mL-1VB2標準溶液(置陰暗處保存)，冰乙酸(AR)，
多維葡萄糖粉試樣
基本操作
1. 打開氙燈，再打開主機，然后打開計算機啟動工作站并初始化儀器。
2. 儀器初始化完畢后，在工作界面上選擇測量項目，設(shè)置適當?shù)膬x器參數(shù)：激發(fā)波長= 440 nm，發(fā)射波長=540 nm。
3. 樣品測定。
4. 退出主程序，關(guān)閉計算機，先關(guān)主機，最后關(guān)氙燈。
實驗步驟
1. 標準系列溶液的配制及標準溶液熒光強度的測定：
在六個干凈的50 mL容量瓶中，分別吸取0.50、1.00、1.50，2.00 、2.50和3.00 mL VB2標準溶液，各加入2.00 mL冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。從稀到濃測量系列標準溶液的熒光強度。
2. 未知試樣的測定:
稱取0.15-0.20 g多維葡萄糖粉試樣,用少量水溶解后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，加2.00 mL冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。用測定標準系列時相同的條件，測量其熒光強度。
數(shù)據(jù)處理
1. 用標準系列溶液的熒光強度繪制標準工作曲線。
2. 根據(jù)待測液的熒光強度，從標準工作曲線上求得其濃度，計算出試樣中VB2含量。
注意事項和問題
維生素B12的在pH為6.0到7.0的條件下，發(fā)出的熒光強度最強，但是在堿性條件下維生素B12會分解，發(fā)射熒光集團被破壞，因此本實驗需要維持在酸性條件下。
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