PCR技術(shù)：Taq DNA聚合酶屬性
重組DNA技術(shù)工具酶
Taq DNA聚合酶 是從一種水生棲熱菌(Thermusaquaticus)yT1株分離提取的.yT是 一種嗜熱真菌，能在70～75℃生長.該菌是1969年從美國黃石國家森林公園火山溫泉 中分離的.
(一)酶活性與熱穩(wěn)定性
該酶基因全長2496個堿基，編碼832個氨基酸，酶蛋白分子為 94KDa.其比活性為200000單位/mg.75～80℃時每個酶分子每秒鐘可延伸約150個核苷 酸，70℃延伸率大于60個核苷酸/秒，55℃時為24個核苷酸/秒.溫度過高(90℃以上) 或過低(22℃)都可影響Taq DNA聚合酶的活性，該酶雖然在90℃以上幾乎無DNA合成， 但確有良好的熱穩(wěn)定性，在PCR 循環(huán)的高溫條件下仍能保持較高的活性.在92.5℃、95℃ 、97.5℃時，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分別經(jīng)130min，40min和5～6min后，仍可 保持50%的活性，實驗表明.PCR反應(yīng)時變性溫度為95℃～20sec，50個循環(huán)后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性.Taq DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性是該酶用于PCR反應(yīng)的前提條 件，也是PCR反應(yīng)能迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的原因.Taq DNA聚合酶還具有逆轉(zhuǎn)錄活性， 其作用于類似逆轉(zhuǎn)錄酶.此活性溫度一般為65～68℃，有Mn2+存在時，其逆轉(zhuǎn)錄活性 更高.
(二)離子依賴性
aqDNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，該酶的催化活性對Mg2+濃度非常敏感.以活性程度 很低的鮭魚精子DNA為模板，dNTP的濃度為0.7～0.8mmol/L時，用不同濃度Mg2+進行 PCR 反應(yīng)10min，測定結(jié)果為Mgcl2濃度在2.0mmol/L時該酶催化活性最高，此濃度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+過高就抑制酶活性，當Mgcl2濃度在 10mmol/L時可抑制40～50%的酶活性.由于Mg2+能與dNTP結(jié)合而影響PCR反應(yīng)液中游離 的Mg2+濃度，因而Mgcl2的濃度在不同的反應(yīng)體系中應(yīng)適當調(diào)整，優(yōu)化濃度.一般反應(yīng) 中Mg2+濃度至少應(yīng)比dNTP總濃度高0.5～1.0mmol/L.適當濃度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50～60%，其最適濃度為50mmol/L，高于75mmol/L時明顯抑制該酶 的活性.
(三)忠實性
TaqDNA聚合酶具有5"→3"聚合酶活性和5"→3"外切酶活性，而無3"→5"外切活 性，它不具有Klenow酶的3"→5"校對活性.因而，在PCR 反應(yīng)中如發(fā)生某些堿基的錯 配，該酶是沒有校正功能的.Taq DNA聚合酶的堿基錯配機率為2.1×10-4.
(四)抑制劑
低濃度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜(DMSO )對Taq DNA聚合酶的 催化活性并無影響.極低濃度的離子表面活性劑如脫氧膽胺酸鈉(小于0.06%)，十二烷 基肌氨酸鈉(小于0.02%)，十二烷基硫酸鈉(SDS，小于0.01%)幾乎可完全抑制該酶的 活性.而非離子表面活性劑在較高濃度(Tween20，NP-40.和Tritox-100)如>5%時方能 抑制該酶的活性.
變性劑對TaqDNA聚合酶活性的影響
變性劑 | 濃度 | 活性(%) |
乙醇 | ≤3% | 100 |
10% | 110 | |
尿素 | ≤0.5mol/L | 100 |
1.0mol/L | 118 | |
1.5mol/L | 107 | |
2.0mol/L | 82 | |
DMSO | ≤1% | 100 |
10% | 53 | |
20% | 11 | |
DMF | ≤5% | 100 |
10% | 82 | |
20% | 17 | |
甲酰胺 | ≤1% | 100 |
15% | 86 | |
20% | 39 | |
SDS | 0.001% | 105 |
0.01% | 10 | |
0.1% | 〈0.1 |
低濃度的NP-40(0.05%)和Tween20(0.05%)能增強TaqDNA聚合酶的活性.低濃度SDS對 該酶的抑制作用可加入一定濃度的NP-40和Tween20抵消.TaqDNA聚合酶可在-20℃貯 存至少6個月.
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