何為熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）
一、FRET技術(shù)基本原理
熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指兩個熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移（即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移）。FRET是一種非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)的過程，使供體熒光強(qiáng)度降低，而受體可以發(fā)射更強(qiáng)于本身的特征熒光（敏化熒光），也可以不發(fā)熒光（熒光猝滅），同時也伴隨著熒光壽命的相應(yīng)縮短或延長。能量轉(zhuǎn)移的效率和供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對取向、供體與受體之間的距離等因素有關(guān)。作為共振能量轉(zhuǎn)移供、受體對，熒光物質(zhì)必須滿足以下條件：
人們已經(jīng)利用生物體自身的熒光或者將有機(jī)熒光染料標(biāo)記到所研究的對象上，成功地應(yīng)用于核酸檢測、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能分析、免疫分析及細(xì)胞器結(jié)構(gòu)功能檢測等諸多方面。（傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料吸收光譜窄，發(fā)射光譜常常伴有拖尾，這樣會影響供體發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊程度，而且供、受體發(fā)射光譜產(chǎn)生相互干擾。最新的一些報道將發(fā)光量子點(diǎn)用于共振能量轉(zhuǎn)移研究,克服了有機(jī)熒光染料的不足之處。相對于傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料分子，量子點(diǎn)的發(fā)射光譜很窄而且不拖尾，減少了供體與受體發(fā)射光譜的重疊，避免了相互間的干擾；由于量子點(diǎn)具有較寬的光譜激發(fā)范圍，當(dāng)它作為能量供體時，可以更自由地選擇激發(fā)波長，可以最大限度地避免對能量受體的直接激發(fā)；通過改變量子點(diǎn)的組成或尺寸，可以使其發(fā)射可見光區(qū)任一波長的光，也就是說它可以為吸收光譜在可見區(qū)的任一生色團(tuán)作能量供體，并且保證了供體發(fā)射波長與受體吸收波長的良好重疊，增加了共振能量轉(zhuǎn)移效率。）
以GFP的兩個突變體CFP（cyan fluorescent protein）、YFP（yellow fluorescent protein）為例簡要說明其原理：CFP的發(fā)射光譜與YFP的吸收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B，當(dāng)它們足夠接近時，用CFP的吸收波長激發(fā)，CFP的發(fā)色基團(tuán)將會把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團(tuán)上，所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。兩個發(fā)色基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比，對空間位置的改變非常靈敏。例如要研究兩種蛋白質(zhì)a和b間的相互作用，可以根據(jù)FRET原理構(gòu)建融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白質(zhì)b、YFP（yellow fluorescent protein）。用CFP吸收波長433 nm作為激發(fā)波長，實驗靈巧設(shè)計，使當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b沒有發(fā)生相互作用時，CFP與YFP相距很遠(yuǎn)不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而檢測到的是CFP的發(fā)射波長為476 nm的熒光；但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b發(fā)生相互作用時，由于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構(gòu)象變化，使CFP與YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時檢測到的就是YFP的發(fā)射波長為527 nm的熒光。將編碼這種融合蛋白的基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這樣就可以在活細(xì)胞生理條件下研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用。
二、FRET技術(shù)的應(yīng)用
隨著生命科學(xué)研究的不斷深入，對各種生命現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)制，特別是對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的研究變得尤為重要。而要想在這些方面的研究取得重大突破，技術(shù)進(jìn)步又是必不可少的。一些傳統(tǒng)的研究方法不斷發(fā)展，為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的研究提供了極為有利的條件，但同時這些研究手段也存在不少缺陷：如酵母雙雜交、 磷酸化抗體 、免疫熒光、放射性標(biāo)記等方法應(yīng)用的前提都是要破碎細(xì)胞或?qū)?xì)胞造成損傷，無法做到在活細(xì)胞生理條件下實時的對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用進(jìn)行動態(tài)研究。FRET技術(shù)的應(yīng)用結(jié)合基因工程等技術(shù)正好彌補(bǔ)了這一缺陷，下面是FRET技術(shù)在相關(guān)生命科學(xué)領(lǐng)域中的具體應(yīng)用。
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