應用熒光素酶-ATP法檢測活性污泥的生物活性
簡介：
眾所周知，活性污泥工業(yè)的處理效率與污泥微生物的活性密切相關。微生物活性越大，處理效果就越好；反之，效果就越差。通常我們使用混合液懸浮固體濃度(MLSS)、混合液揮發(fā)懸浮固體濃度(MLVSS)、污泥沉降比(SV)、污泥容積指數(shù)(SVI) 、污泥齡(TS) 等指標來衡量微生物活性，并以F/M的形式進行評述。
隨著研究的深入及測量技術的進步，人們發(fā)現(xiàn)用MLSS(或MLVSS) 來衡量活性污泥中微生物的活性不夠確切，因為MLSS(或MLVSS) 中也包括了與凈化無關的非活性物質(zhì)在內(nèi)。即不能將活的細胞與有機殘體(如已經(jīng)死亡的微生物殘體) 區(qū)分開，用它來作為衡量生物量的指標并不準確。
為此，人們開始嘗試用脫氫酶活性(DHA)、比耗氧速率(SOUR) 和三磷酸腺苷(ATP) 等生物指標來反映微生物活性。而在這些指標中，ATP廣泛存在于生物細胞內(nèi)，是生物體內(nèi)能量代謝的重要產(chǎn)物和細胞代謝可利用能量的攜帶者，并參與生物體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪的生化合成、吸收等反應。
所以，通過測定ATP含量的多少，可以直接反映細胞活性、微生物的數(shù)量，而且它的測定方法簡單快速。將ATP應用于污泥生物活性的檢測，已經(jīng)引起廣泛地關注。
原理：
ATP含量檢測可以用吸光度檢測、發(fā)光檢測或同位素等方法實現(xiàn)。傳統(tǒng)的吸光度檢測法，檢測靈敏度低，線性范圍窄，難以準確檢測ATP狀況。
而應用熒光素酶發(fā)光方法檢測ATP，具有極高的靈敏度和極寬的檢測范圍，而且簡便、快速，是目前最為流行的方法。該方法基于螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase）催化熒光素氧化，消耗ATP，發(fā)出光子的高效發(fā)光反應，具有發(fā)光效率極高、發(fā)光量與ATP含量呈很好的線性關系的特點。
檢測方法：
1．所需器材
專用檢測儀
專用檢測試劑盒（包含ATP標準品，裂解液，檢測液）
活性污泥樣品
2． 試驗方案
2.1 試劑準備
（1）稀釋Lysis Buffer：將Lysis Buffer室溫溶化，用無菌水5倍稀釋使用。
（2）配制L/L檢測液：L/L Buffer室溫溶化后，作為稀釋液將L/L substrate進行50倍稀釋，配制成L/L檢測液。
（3）ATP標準品的配制：用Lysis Buffer將ATP標準品進行10倍梯度稀釋，制作10-12至10-17mol/μl濃度的ATP標準樣品。
2.2 ATP標準曲線
（1）取10-12至10-17mol/μl濃度的ATP標準樣品各10μl，分別加入50μl的L/L檢測液，混合后放入發(fā)光檢測儀檢測（發(fā)光強度RLU）。
（2）根據(jù)ATP標準品與相應發(fā)光強度制作ATP-RLU標準曲線。
2.3 活性污泥樣品檢測
（1）抽取一定量的活性污泥，并混合為均勻懸液。
（2）取10μl活性污泥懸液，加入50μl Lysis Buffer，混合均勻，靜置5分鐘；然后加入50μl L/L檢測液，并混合均勻，放入檢測儀檢測，獲得總ATP發(fā)光強度。
（3）取10μl活性污泥懸液，加入50μl 純水，混合均勻，靜置5分鐘；然后加入50μl L/L檢測液，并混合均勻，放入檢測儀檢測，可獲得水中游離ATP發(fā)光強度。（通常游離ATP占總ATP的比例小于1%）
（4）將樣品發(fā)光強度帶入標準曲線方程，獲得樣品中ATP含量。
（5）通過檢測不同處理后的活性污泥或不同來源的活性污泥，可獲得活性污泥的活性變化。
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